基于1H qNMR的膳食纤维组分中单糖鉴定与定量新方法开发及其应用

《Communications Chemistry》：Development of a 1H qNMR method for the identification and quantification of monosaccharides in dietary fibre fractions

本研究针对传统膳食纤维(DF)分析方法无法提供分子水平单糖组成信息、样品前处理复杂等问题，开发了一种基于质子核磁共振(1H NMR)光谱的直接分析技术。该方法无需衍生化或中和步骤即可对AOAC流程获得的DF水解组分（主要为果胶、半纤维素和纤维素）进行定性和定量分析，不仅能准确测定单糖组成，还可同步检测碳水化合物修饰（甲基化和乙酰化）及降解产物。验证结果表明该方法与GC-MS具有可比性，且对糖醛酸的回收率更高，样品制备和采集时间更短，为DF的全面分析提供了强大工具。

　　

膳食纤维作为人类饮食的重要组成部分，近年来因其对消化健康、血糖和胆固醇调节、饱腹感以及益生元效应等健康益处而受到广泛关注。然而，膳食纤维的健康效应高度依赖于其具体类型和结构。传统上，膳食纤维的含量主要通过重量法（如Van Soest法和AOAC法）进行量化，这些方法虽然能够测定DF的总量、可溶性膳食纤维(SDF)和不溶性膳食纤维(IDF)等粗分，但无法提供分子水平的详细信息，例如单糖的组成和结构修饰。色谱技术（如GC-MS或LC-MS）虽然能提供更深入的分子信息，但通常需要复杂的样品前处理步骤，包括衍生化以及（在使用硫酸水解时）繁琐的中和过程，这限制了其分析效率和通量。特别是对于糖醛酸等组分，GC-MS分析中的衍生化步骤可能存在回收率低的问题，导致结果低估。因此，开发一种快速、准确且能提供全面结构信息的DF分析方法，对于深入理解其结构与功能关系、推动其在食品、保健品和医药领域的应用至关重要。

为了解决上述挑战，意大利帕尔马大学食品与药品系的Augusta Caligiani团队在《Communications Chemistry》上发表了一项研究，开发并验证了一种基于定量质子核磁共振(¹H qNMR)光谱的方法，用于膳食纤维组分中单糖的鉴定和定量。该方法的关键优势在于能够直接分析经酸水解的DF组分，无需衍生化或中和步骤，并同时提供单糖组成、碳水化合物修饰（如甲基化和乙酰化）以及降解产物的信息。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几个关键技术方法：首先，采用AOAC 991.43官方方法从食品基质（如橙子副产品、榛子壳、石莼藻）中分离可溶性与不溶性膳食纤维组分，并进行序列酸水解（先使用三氟乙酸(TFA)水解SDF和部分IDF，再使用硫酸(H₂SO₄)水解剩余的纤维素部分）。其次，建立并验证了¹H qNMR分析流程，使用600 MHz NMR谱仪，以TSP-D4为内标，在酸性条件（2N TFA, pH 0.5）下采集¹H-NOESY谱图，重点分析单糖的异头氢信号区域（4.5-5.5 ppm）以及其他特征信号。最后，将qNMR分析结果与传统的GC-MS方法进行对比，以评估新方法的准确性和可靠性。

结果与讨论

信号识别（特异性）

研究人员首先建立了目标单糖（包括葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、核糖(Rib)、葡萄糖醛酸(GlcA)和半乳糖醛酸(GalA)）在2N TFA中的光谱库。酸性条件有助于更好地分离不同单糖的异头氢信号，并避免与溶剂（水）信号重叠。通过对各单糖异头质子信号的化学位移、偶合常数和积分特征进行系统指认（文章表1），确保了方法的特异性。对于果糖（其异头氢信号不在典型区域）和核糖（其呋喃糖形式信号易重叠）等特殊情况，研究者通过监测其变旋平衡并采用稳定比例进行校正，从而实现了准确量化。

1H-NOESY NMR spectrum(600 MHz) of the anomeric region of standard monosaccharides. The doublet at 4.76 ppm corresponds to the β H5 proton near the COOH group of galacturonic acid, which, at acidic pH, shifts into the anomeric region; thus, this signal was not used for quantification.'>

弛豫延迟评估

为确保定量准确性，研究者评估了弛豫延迟(d1)对信号积分的影响。通过测试不同弛豫延迟（5-30秒）下单糖标准混合物和实际食品样本中选定信号（包括甲酸、乙酸、甲醇、糠醛等降解产物）的积分稳定性，确定5秒的弛豫延迟足以使除甲酸外（其完全弛豫需15秒）的所有分析物信号实现准确定量。权衡分析时间与准确性后，最终选择5秒作为方法参数。

方法验证

该方法在线性、检测限(LOD)与定量限(LOQ)、准确度、精密度（日内与日间）以及基质效应等方面进行了全面验证。线性范围在100-1500 ppm内，所有单糖的标准曲线决定系数(R2)均大于0.99。LOD和LOQ（基于信噪比S/N）分别设定为25 ppm和100 ppm。准确度（测量值与真实值之比）大多在95%-105%之间，精密度（以相对标准偏差RSD%表示）良好，HorRat值均小于2，符合国际指南要求。基质效应评估显示，在果胶、木聚糖和纤维素水解液中加标回收率在91.2%至104.5%之间，表明基质干扰极小。

方法应用

标准膳食纤维中的应用

该方法成功应用于标准DF（果胶、木聚糖和纤维素）的分析。对于柑橘果胶，¹H NMR测得的半乳糖醛酸含量为74.4±0.8%（干基），甲基化度为61±1.4%，与产品规格一致，且单糖分布与GC-MS结果相当。然而，NMR测得的果胶回收率（99±2%）显著高于GC-MS（54±1%），这主要归因于GC-MS对糖醛酸衍生化步骤的局限性以及果胶水解不完全。NMR能够通过积分5.08-5.16 ppm区域的信号（代表未完全水解的果胶寡聚体）将这部分包含在总果胶量化中，从而获得更全面的结果。对于山毛榉木聚糖，NMR测得木糖含量为77.1±0.3%，并检测到降解产物（如糠醛）。纤维素分析结果显示其几乎完全由葡萄糖组成。这些应用证明了¹H NMR在量化单糖的同时，还能有效监测水解状态和降解产物，这是GC-MS难以实现的。

膳食纤维样品中的应用

该方法进一步应用于实际食品基质（橙子副产品、榛子壳、石莼藻）中提取的SDF和IDF。对于橙子副产品，SDF主要由半乳糖醛酸(40%)、阿拉伯糖(20%)、半乳糖(17%)和鼠李糖(8%)组成，表明存在阿拉伯半乳聚糖、同型半乳糖醛酸和鼠李糖半乳糖醛酸-I。IDF中则发现含有大量不溶性果胶（如鼠李糖半乳糖醛酸-II）以及纤维素。榛子壳的SDF富含半乳糖醛酸(56%)，表明果胶是主要成分，同时检测到甘露糖(20%)，提示存在葡甘露聚糖。石莼藻的SDF主要成分是鼠李糖(50%)，符合石莼聚糖(ulvan)的特征，且未检测到甲基化或乙酰化，与藻类多糖多以硫酸酯化修饰的特点一致。通过单糖组成分析，研究者能够更精确地解析IDF中各组分（如果胶、半纤维素、纤维素和木质素）的比例。

1H NMR. d.p. are degradation products.'>

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与传统分析方法的相关性

将¹H NMR与GC-MS对标准品和实际样品的单糖定量结果进行Pearson相关性分析显示，对于葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸等主要单糖，两者高度相关（r > 0.93）。而对于果糖、核糖和岩藻糖等在某些样品中含量较低（<2%）的单糖，相关性不显著，这主要是由于低含量组分易受仪器灵敏度、背景噪音和检测限波动的影响。

结论与意义

本研究成功开发并验证了一种基于¹H qNMR的膳食纤维单糖分析方法。该方法将DF的AOAC组分分离与序列酸水解策略与¹H NMR分析相结合，不仅避免了繁琐的衍生化和中和步骤，大大缩短了样品前处理和时间，还能够同步提供单糖组成、碳水化合物修饰（甲基化、乙酰化）以及降解产物的信息，从而获得比传统GC-MS更全面、更真实的DF结构图谱。其高回收率（尤其对糖醛酸）和监测部分水解组分的能力，使其在DF的精细表征方面展现出显著优势。该方法的建立为深入理解膳食纤维的结构复杂性、分布及其与生理功能的关联提供了强大的分析工具，将有力推动膳食纤维在功能性食品和饲料开发中的应用。