杏仁干热处理中沙门氏菌与屎肠球菌共接种方法的评估及替代菌株适用性研究

《Journal of Food Protection》：Evaluation of a co-inoculation method for Salmonella enterica and Enterococcus faecium NRRL B-2354 on whole and broken almonds exposed to dry heat

本研究针对低水分食品加工验证中传统分别接种法存在的变异性问题，开发了沙门氏菌（Salmonella enterica）与其替代菌株屎肠球菌（Enterococcus faecium）NRRL B-2354的共接种方法。通过验证选择性培养基（CHROMagar Salmonella、TSAR、S+B agar）的专一性，证实该方法可精准量化共接种微生物在168°C干热处理下的热灭活行为。结果表明，E. faecium 在完整杏仁中表现出优于或相当于 Salmonella 的热抗性，支持其作为杏仁干热处理的保守替代菌株；而破碎杏仁结构对 E. faecium 的灭活影响更显著，提示微生物热响应具有物种依赖性。该共接种策略为低水分食品病原体-替代菌对比研究提供了更精准的实验平台。

　　

在低水分食品领域，沙门氏菌（Salmonella enterica）引发的食源性疾病暴发屡见不鲜，尤其是坚果类产品。为确保食品安全，美国《食品安全现代化法案》（FSMA）要求食品加工者必须验证其杀菌工艺的有效性。例如，加州杏仁产业标准规定，杏仁加工需实现沙门氏菌至少4-log的灭活。然而，工艺验证中常使用非致病性替代微生物（如屎肠球菌 Enterococcus faecium NRRL B-2354）模拟病原体行为，以降低实验风险。传统实验室研究通常将病原体与替代菌分别接种于不同样品，再并行进行热处理。这种方法虽普遍，却存在明显缺陷：样品间的微环境差异（如干燥速率、热渗透性等）会引入额外变异性，影响病原体与替代菌灭活效果比较的准确性。

为解决上述问题，加州大学戴维斯分校食品科学与技术系的Yucen Xie、Christopher Theofel、Vanessa Lieberman和Linda J. Harris在《Journal of Food Protection》上发表研究，提出一种共接种（co-inoculation）方法，将沙门氏菌与屎肠球菌同时接种于同一杏仁样品，使二者暴露于完全相同的加工条件下，从而更精准地比较其热抗性。该研究不仅验证了选择性培养基在区分共接种微生物方面的可靠性，还系统评估了屎肠球菌作为沙门氏菌替代菌在干热处理中的适用性，并深入探讨了杏仁物理形态（完整与破碎）对微生物灭活的影响。

研究团队采用的关键技术方法包括：利用选择性培养基（CHROMagar Salmonella、TSAR（含50 μg/mL利福平的胰蛋白胨大豆琼脂）、Slanetz & Bartley琼脂）进行微生物区分计数；通过重力对流烤箱在168°C下对共接种的完整与破碎杏仁进行长达12分钟的热处理；使用线性回归与统计检验（如ANOVA、Tukey检验、Wald t检验）分析微生物灭活数据的等效性；并利用热电偶实时监测烤箱内温度分布以确保处理条件一致性。杏仁样本来源于经环氧丙烷处理的商业产品（Blue Diamond Growers），其背景菌落数低于40 CFU/g。

验证选择性培养基对共接种细菌的区分计数能力

研究人员首先验证了CHROMagar Salmonella（ChromSal）、TSAR和S+B琼脂分别对沙门氏菌（包括野生型Salmonella-wt和利福平抗性型Salmonella-rif）及屎肠球菌的选择性。结果显示，各培养基均能特异性回收目标菌株，且混合接种时未出现交叉生长。例如，Salmonella-wt在ChromSal上生长良好（10.7±0.3 log CFU/mL），但在TSAR和S+B上未被检测到；E. faecium在S+B上计数为10.0±0.3 log CFU/mL，而在ChromSal和TSAR上无生长。这表明选择性培养基能够准确、专一地枚举共接种样品中的目标微生物。

干热处理期间共接种沙门氏菌和屎肠球菌的存活曲线

热处理过程中，沙门氏菌和屎肠球菌的灭活曲线均呈现“肩形”特征（先稳定后下降）。在168°C处理12分钟后，两种微生物在完整和破碎杏仁上均达到约3-log的灭活水平。初期（4分钟内），沙门氏菌的灭活率（0.2-log）显著高于屎肠球菌（P<0.05），但随处理时间延长，二者灭活程度无显著差异。这一结果为后续等效性分析提供了数据基础。

沙门氏菌野生型与利福平抗性型灭活效果比较

通过线性回归分析发现，Salmonella-wt与Salmonella-rif在完整杏仁（斜率=0.945，95% CI 0.852–1.04）和破碎杏仁（斜率=1.07，95% CI 0.950–1.18）上的灭活率无显著差异（P>0.05），且回归斜率与理想1:1线吻合。这表明利福平抗性菌株可作为野生型沙门氏菌的有效替代，用于共接种研究。

热处理后屎肠球菌和共接种沙门氏菌利福平抗性型计数培养基的比较

热损伤可能影响微生物在选择性培养基上的生长。实验发现，经10分钟热处理后，E. faecium在非选择性TSA和选择性S+B琼脂上的回收率无显著差异（均为5.8 log CFU/g），说明热损伤程度较低。同时，Salmonella-rif在ChromSal和TSAR上的灭活数据高度一致（完整杏仁斜率=1.03，破碎杏仁斜率=1.04），进一步验证了选择性培养基在热处理后计数中的可靠性。

评估共接种屎肠球菌作为沙门氏菌利福平抗性型在干热处理中的替代菌

等效性分析显示，在完整杏仁上，E. faecium的灭活率显著低于Salmonella-rif（斜率=0.733，95% CI 0.645–0.823，P<0.0001），表明E. faecium具有更强的热抗性；而在破碎杏仁上，二者灭活率无显著差异（斜率=1.02，95% CI 0.930–1.11）。这一结果支持E. faecium作为沙门氏菌的保守替代菌，尤其在完整杏仁的干热处理中。

完整和破碎杏仁上的菌群减少情况

杏仁形态对微生物灭活的影响因菌种而异：Salmonella-rif在完整与破碎杏仁上的灭活率无显著差异（斜率=0.950）；而E. faecium在破碎杏仁上的灭活率显著高于完整杏仁（斜率=1.29，95% CI 1.12–1.46，P=0.0017）。研究人员推测，破碎杏仁增大的表面积和油脂释放可能通过影响水分蒸发、热渗透或微生物膜完整性（尤其是革兰氏阳性菌E. faecium缺乏外膜保护）导致其热敏感性升高。

本研究通过共接种方法证实，屎肠球菌NRRL B-2354在杏仁干热处理中表现出相当于或优于沙门氏菌的热抗性，支持其作为安全、保守的替代微生物。研究还揭示了杏仁物理结构对微生物灭活的物种依赖性影响，为低水分食品加工验证提供了更精准的实验策略。该方法不仅减少了样品间变异性，还通过选择性培养基和利福平抗性菌株确保了计数的准确性，为后续工业化规模验证研究奠定了可靠基础。未来研究可拓展至其他低水分食品矩阵及更广泛的处理条件，以进一步验证共接种方法的普适性。