金黄色葡萄球菌细胞色素P450脱羧酶对C18单不饱和脂肪酸的脱羧机制：光谱、结构与动力学研究

《Journal of Inorganic Biochemistry》：The cytochrome P450 decarboxylase from Staphylococcus aureus can produce a diene from a C18 monounsaturated fatty acid: A spectroscopic, structural and kinetic characterisation

本研究针对细胞色素P450 152家族（CYP152）过氧化物酶在生物燃料生产中的应用潜力，系统表征了金黄色葡萄球菌来源的OleTSa脱羧酶与反式单不饱和C18:1脂肪酸（反油酸）的相互作用机制。研究人员通过光谱学、热力学、动力学和X射线晶体学方法，首次发现OleTSa可高效脱羧反油酸生成十七碳-1,8-二烯，其反应速率和化学选择性与饱和脂肪酸底物相当。该研究拓展了CYP152酶的可持续底物空间，为生物燃料生产提供了新思路。

　　

在绿色化学和可持续能源领域，如何高效地将可再生资源转化为高附加值化学品一直是科学家们面临的重大挑战。脂肪酸作为自然界最丰富的生物质资源之一，其转化利用技术备受关注。自然界中存在着一类特殊的酶——细胞色素P450（Cytochrome P450, CYP）过氧化物酶，它们能够以过氧化氢（H₂O₂）为唯一氧化剂，催化脂肪酸的脱羧反应生成终端烯烃，这些烯烃正是"即用型"生物燃料的重要组成成分。

在P450酶超家族中，CYP152家族成员展现出独特的催化能力。其中，来自Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456的OleT_JE是最具代表性的脂肪酸脱羧酶，它能将饱和脂肪酸转化为α-烯烃。然而，自然界中更常见且更具应用潜力的是不饱和脂肪酸，它们不仅是生物体系中的重要组分，也是可再生脂肪酸原料的主要成分。尽管已有研究表明某些CYP152酶能够对不饱和脂肪酸进行脱羧反应，但关于其催化机制和结构基础的系统研究仍较为缺乏。

这项发表在《Journal of Inorganic Biochemistry》上的研究，聚焦于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）来源的OleT_Sa脱羧酶，意外发现该酶在异源表达纯化过程中与一种反式单不饱和C_18:1脂肪酸（反油酸，elaidic acid）共纯化。这一发现促使研究人员深入探讨OleT_Sa与不饱和脂肪酸的相互作用机制，并与传统的饱和脂肪酸底物进行系统比较。

研究人员运用了多项关键技术方法开展本研究：通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）鉴定共纯化脂肪酸成分并进行代谢谱分析；利用电子吸收光谱和电子顺磁共振（EPR）光谱研究酶的光谱特性和自旋态平衡；采用停流光谱技术分析酶反应动力学；通过X射线晶体学解析酶的三维结构；并构建系列定点突变体探讨关键残基的功能。

研究结果方面，光谱特征分析显示，纯化的OleT_Sa呈现混合高低自旋Fe(III)血红素特征，表明与脂肪酸底物结合。共纯化脂肪酸鉴定确认其为反式-9-十八碳烯酸（反油酸）。代谢谱分析表明，OleT_Sa能够以相同速率和化学选择性将反油酸转化为十七碳-1,8-二烯，将硬脂酸转化为1-十七碳烯。结合亲和力测定显示，反油酸与酶的亲和力比硬脂酸高三倍以上。自旋态平衡研究发现，不同链长脂肪酸对酶的自旋态平衡常数（K_spin）有显著影响。EPR光谱揭示了酶中存在复杂的低自旋和高自旋血红素物种。停流动力学分析捕获了Compound I和Compound II中间体，并测定了各步反应速率常数。晶体结构解析展示了酶与反油酸的结合模式，发现乙酸根离子可竞争性占据催化中心。定点突变研究探讨了底物结合腔中关键残基的功能，发现这些突变虽影响光谱特性，但不改变酶的化学选择性。

本研究系统阐明了OleT_Sa脱羧酶与不饱和脂肪酸的相互作用机制，证明具有延伸F/G环的CYP152成员能够有效催化反式单不饱和脂肪酸的脱羧反应。研究发现，尽管底物结合腔中的残基替换会影响酶的光谱特性和底物结合能力，但这些变化并不改变酶的化学选择性，表明CYP152脱羧酶对底物结构具有一定的包容性。更重要的是，该研究拓展了CYP152酶的可持续底物空间，为利用不饱和脂肪酸资源生产生物燃料提供了理论依据和技术支持。

这项工作的意义在于首次全面表征了OleT_Sa与不饱和脂肪酸的脱羧机制，揭示了酶与底物相互作用的动态特性，为理性设计高效、稳定的脂肪酸脱羧酶催化剂奠定了坚实基础。随着对CYP152家族酶学特性的深入理解，这类酶有望在绿色生物制造领域发挥越来越重要的作用，推动可持续能源技术的发展。