衰老脾脏溶血微环境诱导T细胞铁死亡抵抗与功能衰退的机制研究

《Nature Aging》：Heme and iron toxicity in the aged spleen impairs T cell immunity through iron deprivation

本研究针对衰老过程中T细胞功能衰退的机制，发现衰老脾脏微环境通过溶血作用释放血红素和铁，诱导T细胞产生铁死亡抵抗，但代价是损害其增殖和免疫功能。研究人员通过蛋白质组学、流式细胞术和动物模型等技术，揭示衰老脾脏中积累的血红素和铁导致T细胞铁代谢紊乱和氧化应激，进而通过上调CD39等抑制性分子和损害蛋白稳态，削弱T细胞对疫苗接种的应答。该研究不仅阐明了器官特异性微环境在免疫衰老中的关键作用，还为改善老年人免疫功能提供了新的干预策略。

　　

随着全球人口老龄化加剧，理解免疫系统衰老的机制变得愈发重要。免疫衰老（Immunosenescence）是伴随衰老过程出现的免疫系统功能衰退，尤其影响适应性免疫的关键细胞——T淋巴细胞。衰老的T细胞表现出增殖能力下降、效应功能减弱、抑制性受体表达上调以及对疫苗接种应答不佳等特征。传统研究多聚焦于T细胞自身的内在改变，然而，近年来科学家们意识到，T细胞所处的微环境在驱动其衰老表型中可能扮演着至关重要的角色。脾脏作为体内最大的次级淋巴器官，是T细胞激活和发挥作用的重要场所，但其在衰老过程中的变化及其对T细胞功能的影响尚不清晰。衰老个体常伴有贫血和红细胞周转异常，这可能导致脾脏内环境稳态的改变。那么，衰老的脾脏是否会创造一个独特的微环境，进而“教育”或“重塑”其中的T细胞，使其呈现衰老特征？这是本研究致力于回答的核心科学问题。

为了深入探究这一问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究以年轻（7-10周）和老年（21-23个月）的C57BL/6雌性小鼠为主要模型。通过流式细胞术详细分析了脾脏和淋巴结来源T细胞的表型与功能。采用蛋白质组学（Label-free定量蛋白质组学）技术比较了年轻与老年小鼠初始CD4⁺ T细胞的整体蛋白表达谱。利用过继转移实验，将年轻转基因报告T细胞（Rosa26tdTomato⁺或OT-I/OT-II）移植到年轻或老年受体小鼠体内，以区分细胞内在因素与微环境的影响。通过脾脏间质液提取、红细胞裂解液模拟溶血环境，以及铁死亡诱导剂（RSL3）和抑制剂（Ferrostatin-1, Liproxstatin-1）处理，在体外验证血红素和铁对T细胞存活和功能的作用。使用FerroOrange探针检测细胞内不稳定铁池，BODIPY? 581/591 C11或Liperfluo探针检测脂质过氧化水平。通过免疫组织化学（如普鲁士蓝铁染色、CD169染色）和ELISA等方法分析脾脏组织病理学和血清学指标。此外，还进行了脾切除术、FTY720介导的淋巴细胞滞留、以及体内铁补充（柠檬酸铁铵）结合疫苗接种等体内干预实验，以验证微环境因素的因果作用。

衰老脾脏与淋巴结的T细胞呈现不同的衰老表型

研究人员首先比较了老年小鼠脾脏和淋巴结（LNs）中CD4⁺ T细胞的状态。发现与淋巴结中的T细胞相比，脾脏来源的T细胞表现出更显著的衰老特征，包括高表达抑制性受体CD39和衰老相关标志物KLRG1、CD95，同时产生效应分子如颗粒酶B（GzB）和IL-10的能力增强，而IL-2的产生减少。即使是在初始T细胞（Na?ve T cells）中，脾脏来源的细胞也呈现出更显著的衰老相关表型。当使用FTY720处理老年小鼠，阻止淋巴细胞从淋巴组织排出后，脾脏和淋巴结T细胞之间的差异表型消失了，这表明T细胞的不同状态是由其所在的局部微环境决定的，而非细胞固有的差异。进一步地，将年轻的T细胞过继转移到老年受体小鼠体内，仅需2周，这些年轻的细胞在老年小鼠的脾脏中也获得了高表达CD39、KLRG1等衰老相关表型，而在老年小鼠的淋巴结中或年轻小鼠的脾脏中则无此现象。这一结果强有力地证明，衰老的脾脏微环境足以诱导T细胞的衰老。

蛋白质组学揭示衰老T细胞适应血红素和铁应激

为了从分子层面理解衰老T细胞的特征，研究人员对年轻和老年小鼠脾脏来源的初始CD4⁺ T细胞进行了定量蛋白质组学分析。结果显示，在静息和活化状态下，老年T细胞均表现出与年轻T细胞显著不同的蛋白质表达谱。基因集富集分析（GSEA）发现，老年T细胞中显著上调的蛋白主要富集在与血红素代谢（Heme metabolism）、铁稳态（Iron homeostasis）和对活性氧（ROS）的反应等通路上。具体而言，参与血红素降解的关键酶——血红素加氧酶-1（HO-1）、胆绿素还原酶A和B（BLVRA, BLVRB），以及铁储存蛋白铁蛋白重链和轻链（FTH1, FTL）的表达在老年T细胞中均显著升高。这些数据提示，衰老T细胞长期处于一种类似于血红素和铁过载的应激状态，并启动了相应的解毒和适应机制。

衰老脾脏创造了一个溶血性微环境

那么，衰老脾脏的微环境究竟有何特殊之处？组织学分析提供了直接证据：老年小鼠脾脏中可见大量的含铁血黄素沉积（普鲁士蓝染色阳性），提示存在慢性的红细胞破坏和铁释放。生化检测证实，老年小鼠脾脏组织的裂解液中游离血红素和胆红素（血红素降解产物）的含量显著高于年轻小鼠。此外，老年小鼠脾脏的间质液（Spleen Interstitial Fluid-enriched fraction, SE）在体外能显著诱导年轻T细胞死亡并抑制其增殖，而年轻小鼠脾脏的间质液则无此作用。这种毒性作用可被铁螯合剂去铁胺（DFO）或血红素清除剂血清白蛋白（BSA）部分逆转。这些发现表明，衰老脾脏是一个溶血性微环境，其中积累的血红素及其释放的铁，对T细胞具有直接的毒性作用。

衰老T细胞获得铁死亡抵抗但付出功能代价

铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡方式。研究人员发现，老年脾脏来源的T细胞对铁死亡诱导剂RSL3的杀伤作用具有显著的抵抗性，表现为在RSL3处理下存活率更高。这种抵抗性可能与细胞适应性地上调了抗氧化防御有关。然而，这种适应并非没有代价。尽管老年T细胞避免了铁死亡，但其增殖能力严重受损。机制探索发现，老年T细胞虽然高表达铁储存蛋白铁蛋白，但其细胞内不稳定铁池（Labile iron pool）却低于年轻T细胞，且转铁蛋白受体（CD71）的表达在活化后上调不足，提示其存在“功能性铁缺乏”。这种铁代谢紊乱可能限制了T细胞在活化后合成DNA和进行细胞分裂所必需的铁供应。给予外源铁（柠檬酸铁铵或铁饱和转铁蛋白）可以显著改善老年T细胞以及处于衰老脾脏环境中的年轻T细胞的增殖能力。在体内，给老年小鼠接种卵白蛋白（OVA）疫苗的同时补充铁，可以增强抗原特异性T细胞的增殖和抗体反应。这表明，衰老脾脏微环境通过诱导铁代谢紊乱，限制了T细胞的克隆扩张和免疫应答能力。

脾脏是驱动T细胞衰老表型的核心器官

为了确认脾脏在衰老相关T细胞功能紊乱中的核心地位，研究人员进行了脾切除术。老年小鼠在脾切除术后，其淋巴结中的T细胞表达CD39的水平显著下降。这证明，衰老脾脏作为溶血微环境的“源头”，系统性影响着机体其他部位的T细胞状态。

研究结论与意义

本研究系统性地揭示了衰老过程中一个此前未被重视的器官特异性微环境——衰老脾脏的溶血状态，是驱动T细胞衰老的关键外部因素。该微环境通过释放血红素和铁，迫使T细胞在“生存”与“功能”之间做出权衡：为了在毒性环境中存活下来，T细胞通过上调HO-1、铁蛋白等分子来抵抗铁死亡，但这一适应过程导致了铁代谢紊乱和氧化应激，进而损害了其增殖能力和效应功能，表现为CD39等抑制性分子的上调以及蛋白稳态的失衡。

这项发表于《Nature Aging》的研究具有重要的理论意义和转化潜力。理论上，它将免疫衰老的研究视角从细胞内在机制拓展到了器官微环境，阐明了脾脏这一特定器官在机体衰老中的独特作用。实践上，研究提示针对脾脏溶血微环境（例如使用血红素清除剂如血红素结合蛋白Hemopexin）或精确调控铁代谢（如在疫苗接种期间适时补铁），可能成为改善老年人免疫功能、增强疫苗效力的新策略。同时，研究也警示，单纯增强蛋白稳态（如使用mTOR抑制剂、亚精胺等）而不改善微环境毒性，可能无法有效逆转T细胞衰老，甚至可能带来风险。因此，未来的抗衰老免疫干预策略需要综合考虑细胞内在状态与外在微环境的共同作用。