针对产肠毒素大肠杆菌热不稳定肠毒素的高灵敏度免疫层析试纸条的改进研究

《Journal of Microbiological Methods》：An improved immunochromatographic test strip that sensitively detects heat-labile enterotoxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli

本研究针对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)产生的热不稳定肠otoxin(LT)检测灵敏度不足的问题，开发了基于单克隆抗体31D11和34D4配对的改进型免疫层析(IC)试纸条。新试纸条可将LT检测限降低至0.15 ng/150 μL，并实现6小时无林可霉素培养的临床样本直接检测，为食品卫生和畜牧防疫提供了快速检测方案。

　　

在发展中国家和畜牧业中，产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)引发的腹泻病一直是重大公共卫生问题。这种细菌通过产生热不稳定肠毒素(Heat-labile enterotoxin, LT)和热稳定肠毒素(Heat-stable enterotoxin, ST)攻击肠道细胞，导致严重的水样腹泻。特别在养猪业中，ETEC引起的断奶后腹泻常导致仔猪高死亡率，造成巨大经济损失。

传统检测方法存在明显局限：早期免疫层析(Immunochromatographic, IC)试纸条对LT的检测灵敏度不足，且需对样本进行长达18小时的林可霉素增强培养，严重影响检测效率。更棘手的是，当时尚无商品化的ST检测试纸条。这些技术瓶颈使得现场快速诊断难以实现，往往错失最佳防控时机。

为突破这一困境，日本兵库县大学人类科学与环境学院微生物实验室的Nana Fujimoto等研究人员开展了一项创新研究。他们巧妙设计了一种LT的B亚基(LTB)与ST的嵌合蛋白，通过小鼠免疫制备特异性单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)。虽然最终获得的9个抗体克隆均针对LTB，但通过筛选获得的高效配对抗体（31D11和34D4）成功将检测灵敏度提升至0.15 ng/150 μL。这项重要研究成果发表在《Journal of Microbiological Methods》上，为ETEC的快速检测提供了新的技术方案。

关键技术方法包括：采用嵌合蛋白免疫技术制备单克隆抗体，通过抗体配对筛选建立免疫层析检测体系，使用临床分离的猪源和人源ETEC菌株进行验证，并采用夹心ELISA法对毒素水平进行定量比对分析。

研究结果

抗体开发与筛选

研究人员通过LTB-ST嵌合蛋白免疫小鼠，获得9个LTB特异性单克隆抗体克隆。经过系统筛选，发现31D11和34D4抗体组合在免疫层析检测中表现最优，能够特异性地识别LT毒素分子。

检测灵敏度评估

改进后的免疫层析试纸条对纯化LT的检测限达到0.15 ng/150 μL，较之前报道的原型试纸条灵敏度显著提高。这一灵敏度水平足以满足临床样本的直接检测需求。

临床样本验证

在不添加林可霉素的条件下，该试纸条能够直接检测猪源和人源临床分离株6小时培养上清液中的LT毒素。与传统方法相比，不仅大幅缩短了检测时间，还简化了前处理步骤。

方法对比验证

通过夹心ELISA对免疫层析结果进行定量验证，结果显示两种方法具有良好的一致性，证实了改进试纸条检测结果的可靠性。这表明新方法能够在更短的培养时间内检测到更低浓度的LT毒素。

研究结论与意义

本研究成功开发了一种高灵敏度的免疫层析检测试纸条，解决了传统ETEC检测方法中存在的灵敏度不足、检测时间长、前处理复杂等关键技术难题。该试纸条无需抗生素增强培养即可实现快速检测，在食品卫生监督和畜牧业疫病防控领域具有重要的应用价值。特别是对养猪场中ETEC引起的断奶后腹泻的早期诊断和防控提供了实用工具，有望降低经济损失并提高动物福利水平。未来研究可继续探索ST特异性抗体的开发，进一步完善ETEC的全面检测方案。