靶向MAT2A通过EZH2介导的H3K27me3修饰协同诱导骨肉瘤细胞DNA损伤

《Journal of Orthopaedic Translation》：Targeting MAT2A synergistically induces DNA damage in osteosarcoma cells through EZH2-mediated H3K27me3 modification

本研究针对化疗耐药骨肉瘤治疗难题，通过单细胞测序发现恶性增殖细胞中甲硫氨酸代谢通路上调，经高通量化合物筛选和体内外实验验证，证实MAT2A抑制剂与EZH2抑制剂联用可协同降低H3K27me3水平并诱导DNA损伤，为代谢-表观遗传联合治疗策略提供新依据。

　　

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）作为最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童和青少年群体。尽管手术技术和化疗方案不断进步，但转移性或复发性骨肉瘤患者的生存率仍然极低。目前临床缺乏有效的治疗手段，迫切需要寻找新的治疗靶点和策略。化疗通常通过诱导DNA损伤来杀死肿瘤细胞，但骨肉瘤细胞往往能通过某种机制耐受DNA损伤，导致化疗耐药。近年研究发现，表观遗传（epigenetics）改变可能在肿瘤细胞耐受DNA损伤过程中发挥关键作用，特别是组蛋白甲基化修饰如H3K27me3（组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化）与化疗耐药密切相关。然而，组蛋白甲基化修饰在骨肉瘤DNA损伤修复调控中的具体作用尚不清楚。

在这项发表于《Journal of Orthopaedic Translation》的研究中，研究人员通过整合单细胞转录组分析、高通量筛选和体内外功能实验，探索了代谢与表观遗传交叉调控在骨肉瘤治疗中的作用机制。研究发现靶向甲硫氨酸代谢关键酶MAT2A（methionine adenosyltransferase 2A）与EZH2（enhancer of zeste homolog 2）抑制剂联用，可协同诱导DNA损伤并抑制骨肉瘤生长，为化疗耐药骨肉瘤提供了新的治疗策略。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先收集了16例骨肉瘤患者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，包含99,416个细胞进行微环境分析；建立了包含540种代谢物的高通量筛选平台；通过体外细胞活力检测（CCK-8法）、集落形成实验、EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入实验评估增殖；利用蛋白质印迹（Western blot）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析组蛋白修饰；采用免疫荧光检测DNA损伤标志物γH2AX（组蛋白H2AX磷酸化）；并构建了裸鼠皮下移植瘤模型验证治疗效果。

3.1. 骨肉瘤微环境中恶性增殖表型肿瘤细胞的甲硫氨酸代谢通路激活

研究人员首先对骨肉瘤肿瘤样本的单细胞转录组数据进行分析，将99,416个细胞划分为13个细胞亚群，包括5个间充质来源亚群（MSC_01至MSC_05）。通过InferCNV分析发现MSC_01亚群具有最高的染色体不稳定性评分，且高表达增殖标志物MKI67和PCNA，被鉴定为恶性肿瘤细胞群体。与其它间充质来源亚群相比，MSC_01中半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路显著上调，表明在骨肉瘤微环境中，恶性增殖肿瘤细胞存在甲硫氨酸代谢通路的激活。

3.2. 高通量筛选鉴定甲硫氨酸代谢对骨肉瘤肿瘤生长的重要性

为了探究代谢物对骨肉瘤细胞恶性增殖和活力的影响，研究人员在HOS/MNNG和143B细胞系上进行了包含540种代谢物的高通量筛选。结果显示L-甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）tosylate能显著增强细胞活力。进一步分析发现，将甲硫氨酸转化为SAM的关键酶MAT2A的高表达与骨肉瘤患者不良预后显著相关，提示MAT2A在骨肉瘤中具有重要功能。

3.3. 抑制MAT2A通过细胞周期和DNA损伤通路抑制骨肉瘤细胞增殖和生长

研究人员检测了多株骨肉瘤细胞系中MAT2A的蛋白和mRNA表达水平，发现骨肉瘤细胞系中MAT2A表达显著高于人间充质干细胞（HMSC）。通过构建MAT2A敲低（knockdown）模型，发现MAT2A敲低可显著抑制骨肉瘤细胞集落形成能力和细胞活力。MAT2A抑制剂PF-9366处理骨肉瘤细胞后，RNA-seq分析显示细胞周期相关通路下调，而DNA损伤相关通路上调，表明抑制MAT2A可通过影响细胞周期和诱导DNA损伤来抑制骨肉瘤生长。

3.4. MAT2A抑制通过EZH2介导的H3K27me3修饰影响体外肿瘤生长

研究发现不同骨肉瘤细胞系对PF-9366的敏感性存在差异，其中143B细胞最敏感，HOS/MNNG次之，HOS最不敏感。这种差异与H3K27me3水平密切相关，143B细胞H3K27me3水平最低，而HOS/MNNG最高。进一步分析发现EZH2（H3K27me3甲基转移酶）表达水平与H3K27me3水平一致，且MAT2A与EZH2蛋白表达比例影响细胞对MAT2A抑制剂的敏感性。在143B细胞中过表达EZH2可提高H3K27me3水平并降低对MAT2A抑制剂的敏感性，临床数据分析也显示EZH2高表达患者预后更差。

3.5. EZH2和MAT2A抑制剂的协同效应增强骨肉瘤细胞DNA损伤

基于上述发现，研究人员测试了EZH2抑制剂GSK126与MAT2A抑制剂PF-9366的联合效果。结果显示，在H3K27me3水平较高的HOS/MNNG和HOS细胞中，两种抑制剂表现出强协同效应，联合处理显著降低H3K27me3水平，同时增加DNA损伤标志物γH2AX和凋亡标志物CASPASE3/7的表达。而在H3K27me3水平较低的143B细胞中，协同效应不明显。

3.6. EZH2抑制剂与甲硫氨酸限制饮食的协同效应抑制体内骨肉瘤生长

动物实验进一步验证了联合治疗策略的效果。使用EZH2抑制剂GSK126和甲硫氨酸限制饮食（methionine-restricted diet, MRD）模拟MAT2A抑制，发现单药治疗均可抑制肿瘤生长，而联合治疗表现出更强的抑瘤效果。免疫组化分析显示联合治疗组Ki67和H3K27me3表达显著降低，γH2AX表达增加，表明联合治疗通过降低H3K27me3水平和诱导DNA损伤来抑制肿瘤生长。

研究结论与讨论部分强调，本研究通过多组学分析揭示了骨肉瘤微环境中恶性增殖细胞存在甲硫氨酸代谢通路激活，并证实MAT2A和EZH2在调控H3K27me3水平和DNA损伤中的关键作用。研究发现MAT2A/EZH2表达比例影响肿瘤细胞对MAT2A抑制剂的敏感性，而联合靶向MAT2A和EZH2可协同诱导DNA损伤并抑制肿瘤生长。这种代谢-表观遗传联合靶向策略为克服骨肉瘤化疗耐药提供了新思路，具有重要的临床转化潜力。然而，研究也存在一定局限性，如未全面考察所有骨肉瘤细胞系的调控机制，以及可能存在的其他H3K27me3调控酶的影响。未来研究需进一步阐明H3K27me3在MAT2A抑制剂耐药中的具体调控机制，并探索联合靶向策略的临床应用前景。