肾脏淀粉样变性中淀粉样特征蛋白定量谱的鉴定及其临床意义

《BMC Nephrology》：Identifying the quantity profiles of amyloid signature proteins in different types of renal amyloidosis

本研究针对肾脏淀粉样变性中特征蛋白表达谱不明确的问题，通过质谱分析和免疫染色方法系统研究了SAP、ApoE和ApoA-IV在不同类型肾脏淀粉样变性（AL-κ/λ、AA、ALECT2）中的定量特征。研究发现ApoE是肾脏淀粉样变性的关键特征蛋白，而ApoA-IV在ALECT2型中缺失。通过激光扫描共聚焦显微镜和免疫电镜半定量分析，发现AL-κ型中特征蛋白水平较低。该研究为淀粉样变性的靶向治疗提供了新思路。

　　

在医学领域，淀粉样变性是一种由错误折叠蛋白质形成不溶性纤维沉积导致的蛋白质构象疾病。目前已知有42种前体蛋白可引起人类淀粉样变性，其中三分之一会影响肾脏功能。在系统性淀粉样变性中，肾脏的所有组成部分包括肾小球、肾小管间质和血管都可能受累。最常见的肾脏淀粉样变性类型包括轻链型淀粉样变性（AL）、淀粉样A蛋白型淀粉样变性（AA）和白细胞趋化因子2型淀粉样变性（ALECT2）。

除了淀粉样纤维的内在成分外，淀粉样沉积物通常还伴随着细胞外蛋白的沉积，主要包括血清淀粉样P成分（SAP）、载脂蛋白E（ApoE）和载脂蛋白A-IV（ApoA-IV）等。这些蛋白通常被称为淀粉样特征蛋白，据报道它们参与淀粉样纤维的沉积和进展过程，并被视为临床试验的治疗靶点。

然而，尽管通过免疫组织化学（IHC）和基于质谱（MS）的蛋白质组学已证明上述蛋白几乎存在于所有类型的淀粉样沉积物中，但它们在各种淀粉样类型和受累区域中的数量水平以及与淀粉样纤维的共定位关系仍不清楚。这一知识空白限制了对这些特征蛋白在疾病发生发展中作用的深入理解，也制约了靶向治疗策略的优化。

为了解决这些问题，北京大学第一医院肾脏病理中心的Wang等研究人员在《BMC Nephrology》上发表了最新研究，系统探讨了常见类型肾脏淀粉样变性中淀粉样特征蛋白的数量特征。研究团队通过质谱和免疫染色方法，结合先进成像技术，揭示了这些特征蛋白在不同类型淀粉样变性中的表达差异和分布特征，为淀粉样变性的精准诊断和靶向治疗提供了重要理论依据。

研究采用了多种关键技术方法：对21例2000-2021年在北京大学第一医院肾脏病理中心评估的不同类型肾脏淀粉样变性患者的肾活检标本进行回顾性分析；应用免疫组织化学和激光显微切割结合质谱技术研究特征蛋白的定位和数量特征；通过激光扫描共聚焦显微镜和免疫电镜检查特征蛋白与淀粉样纤维的共定位关系及超微结构定位。

研究结果从多个层面揭示了淀粉样特征蛋白的表达特征：

淀粉样特征蛋白在肾脏淀粉样和非淀粉样组织中的定位

研究人员首先通过IHC研究了特征蛋白在正常人肾组织中的定位。发现SAP在肾小球中染色强烈，主要分布在肾小球基底膜，血管中染色较弱；ApoE在正常人肾组织中未检测到；ApoA-IV在肾小管尤其是近端小管中有明显染色，在肾小球或血管中未观察到染色。

在肾脏淀粉样组织中，SAP和ApoE在所有淀粉样病例中均被检测到，而ApoA-IV在AL（κ和λ）和AA中被鉴定，但在ALECT2中缺失。除肾小球中的淀粉样沉积外，研究还发现在所有淀粉样类型的肾小动脉和肾小管间质淀粉样区域中，SAP和ApoE均存在，ApoA-IV存在于AL（κ和λ）和AA的淀粉样负荷区域，但不存在于ALECT2中。

肾脏淀粉样和非淀粉样组织中淀粉样特征蛋白的质谱分析

LMD-MS分析在所有病例中进行。在3个非淀粉样组织中，两个病例检测到低水平的SAP，而ApoE和ApoA-IV未通过MS检测到。在12例AL病例中，10例鉴定出了克隆型免疫球蛋白轻链可变区基因。对于AA和ALECT2病例，除一例ALECT2因淀粉样沉积不足未能检测到LECT2蛋白外，所有其他病例均成功鉴定出前体蛋白的光谱数，证实了之前的IHC发现。

SAP普遍存在于所有类型的淀粉样变性中。在AL和AA中鉴定出大量的ApoE光谱数，在ALECT2淀粉样变性中ApoE的光谱数较小。与SAP和ApoE普遍存在于淀粉样沉积物中不同，MS分析显示ApoA-IV在AL和AA中被鉴定，而在ALECT2中为阴性。通过半定量测量特征蛋白的丰度，发现MS检测到的淀粉样沉积物中ApoE的丰度相对高于其他两个特征蛋白。

通过LSCM和IEM对肾脏淀粉样组织中淀粉样特征蛋白的定量

为了揭示淀粉样特征蛋白与淀粉样纤维之间的共定位关系，并评估特征蛋白的数量水平，研究人员应用LSCM显示特征蛋白的免疫荧光以及硫磺素T（ThT）染色标记淀粉样纤维。在肾脏淀粉样组织中，所有类型的淀粉样纤维都被ThT成功标记。

SAP在所有淀粉样类型中均为阳性，并与淀粉样纤维清晰共定位。发现AL-λ和ALECT2中SAP的数量水平显著高于AL-κ，但AL-λ和ALECT2之间无显著差异。研究还发现在单个淀粉样类型的不同淀粉样区域中，其数量水平没有显著差异。

ApoE是淀粉样的主要组成部分，通过免疫荧光鉴定。合并图像显示ApoE在肾脏淀粉样沉积物中与淀粉样纤维良好共定位。ApoE的数量水平在AL-λ和ALECT2之间无显著差异，但在AL-κ中降低。此外，AL-λ和ALECT2在不同淀粉样区域的ApoE数量水平均未显示显著变化。

与IHC和MS分析结果一致，通过免疫荧光在ALECT2中未检测到ApoA-IV。在AL（κ和λ）淀粉样沉积物中，发现其为阳性并与淀粉样纤维清晰共定位。至于ApoA-IV的数量水平，发现与AL-κ相比，其在AL-λ中的数量水平显著较高，而AL-λ中淀粉样区域之间未观察到显著差异。

为了确认SAP在淀粉样沉积物中的存在，对AL和ALECT2肾组织标本进行了免疫金电子显微镜分析。在淀粉样纤维所在区域清晰可见对应于λ/κ轻链特异性或LECT2特异性抗体以及SAP特异性抗体的电子致密12纳米金颗粒。当评估SAP的免疫金标记密度时，发现AL-λ或ALECT2中的金颗粒数量显著高于AL-κ，且AL-λ和ALECT2之间无显著差异。这一发现与LSCM揭示的SAP数量水平相关。

研究结论与意义

本研究系统研究了常见类型肾脏淀粉样变性中淀粉样特征蛋白的表达谱及其各自的数量水平。通过IHC研究特征蛋白在不同淀粉样负荷区域的定位，发现在所有测试的肾脏AL、AA和ALECT2淀粉样变性病例中，SAP和ApoE染色均为阳性，进一步详细检查显示在肾脏所有受累区域有相似模式。

通过基于MS的蛋白质组学分析，证实了SAP和ApoE存在于所有测试病例的淀粉样沉积物中。还发现ApoE在所有类型淀粉样沉积物中的光谱数高于SAP和ApoA-IV，通过半定量测量它们的丰度，ApoE在淀粉样沉积物中的丰度在三个特征蛋白中最大。这些发现表明ApoE与前体蛋白（轻链、SAA、LECT2）一样是淀粉样沉积物组织的关键。

与SAP和ApoE在淀粉样变性中普遍存在不同，通过IHC和LSCM对肾脏标本中淀粉样特征蛋白的免疫染色检测显示ApoA-IV存在于AL（κ和λ）和AA淀粉样变性中，而在ALECT2淀粉样变性中缺失，这些发现进一步得到MS分析的验证。基于这些发现，ApoA-IV不能被认为是ALECT2淀粉样变性的特征蛋白。

当使用LSCM时，可以研究淀粉样纤维、前体蛋白和特征蛋白之间的共定位关系。正如预期的那样，这三个特征蛋白在肾脏淀粉样变性中与标记淀粉样纤维的ThT良好共定位。在这些特征蛋白与不同类型淀粉样纤维之间观察到的清晰共定位表明这三种蛋白可以与淀粉样纤维结合，从而参与纤维生成。

通过采用半定量方法比较肾脏淀粉样变性中特征蛋白的数量水平，并通过LSCM计算特征蛋白与ThT的强度比，发现特征蛋白的数量水平在不同类型的淀粉样变性中有所不同，在AL-λ和ALECT2中，数量水平似乎高于AL-κ。此外，IEM验证了SAP的免疫金标记密度在AL和ALECT2中有所不同，AL-κ在这三种类型中金颗粒数量最少。这些发现表明，当特征蛋白参与淀粉样纤维的形成时，特征蛋白与淀粉样前体蛋白之间的比例可能因淀粉样类型而异。

该研究的局限性包括相对较小的样本量，几个病例中要么淀粉样沉积不足以进行MS分析，要么蛋白质未消化成适当大小且肽段并非全部同样电离。此外，未鉴定和比较特征蛋白在其他淀粉样变性受累器官如心脏、肝脏或脂肪组织中的定量谱。

总之，本研究系统研究了常见肾脏淀粉样变性和肾脏不同受累区域中SAP、ApoE和ApoA-IV的定量谱。MS检测到的ApoE相对较高的丰度，结合IHC结果，表明ApoE可能在淀粉样变性的进展和维持中扮演与SAP同样关键的角色。此外，还证实了ApoA-IV在肾脏ALECT2淀粉样变性的淀粉样沉积物中缺失。另外，揭示了这三种淀粉样特征蛋白与淀粉样纤维之间的清晰共定位。基于LSCM/IEM的半定量分析，观察到与AL-κ相比，AL-λ和ALECT2中特征蛋白的组成更高。可以认为，除了临床试验中的SAP外，ApoE也可能成为系统性淀粉样变性的潜在治疗靶点。