姜黄素通过调控CCNA2介导的AKT/STAT通路抑制肺腺癌恶性进展及巨噬细胞M2极化的机制研究

《Letters in Drug Design & Discovery》：Investigating the mechanism of curcumin against LUAD malignant progression and macrophage M2 polarization based on network pharmacology, bioinformatics, and molecular docking

本研究针对肺腺癌(LUAD)高死亡率及靶向治疗不足的临床难题，通过整合网络药理学、生物信息学与分子对接技术，首次揭示天然化合物姜黄素(curcumin)可有效抑制LUAD细胞增殖/迁移/侵袭并促进凋亡，同时阻断巨噬细胞M2极化。核心机制为姜黄素直接靶向细胞周期蛋白A2(CCNA2)，通过抑制AKT/STAT通路发挥抗肿瘤作用，为LUAD的天然药物研发提供新靶点。

　　

肺癌作为全球癌症相关死亡的主要原因，其中肺腺癌(LUAD)占非小细胞肺癌(NSCLC)的很大比例。尽管近年来LUAD的治疗取得了显著进展，但开发有效的靶向疗法仍是未满足的临床需求。同时，传统化疗药物往往伴随较大的副作用，因此寻找高效低毒的新型治疗策略迫在眉睫。在这一背景下，来源于姜科植物的天然多酚类化合物——姜黄素(curcumin)，因其广泛的抗炎、抗氧化和抗癌特性而备受关注。然而，姜黄素在LUAD中的具体作用机制，特别是其与肿瘤微环境中重要组成部分——巨噬细胞的相互作用，尚不明确。发表在《Letters in Drug Design》上的这项研究，旨在系统揭示姜黄素对抗LUAD恶性进展及调控肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)极化的分子机制。

研究人员综合运用了多种关键技术方法。在体外实验中，采用了细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色、流式细胞术、划痕愈合和Transwell实验评估LUAD细胞(A549和H1975)的恶性表型；使用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测基因表达；并通过流式细胞术分析巨噬细胞极化标志物。在生物信息学分析方面，利用GEO数据库筛选差异表达基因(DEGs)，通过CTD、SwissTargetPrediction和GeneCards数据库预测姜黄素作用靶点，并借助STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，使用Cytoscape软件的CytoHubba插件筛选核心靶点。分子对接和分子动力学模拟用于验证姜黄素与核心靶点的结合。临床样本来自西安市中医医院伦理委员会批准的63对LUAD组织及癌旁组织。体内研究则通过建立异种移植小鼠模型，并结合免疫组织化学(IHC)进行验证。

Curcumin inhibits the malignant behaviors of LUAD cell lines

研究人员首先评估了姜黄素对LUAD细胞系的影响。CCK-8实验筛选出40 μM为后续实验浓度。结果显示，与0 μM组相比，40 μM姜黄素处理显著抑制了A549和H1975细胞的活力，减少了EdU⁺增殖细胞比例，增加了凋亡细胞数量，并明显削弱了细胞的迁移和侵袭能力。这表明姜黄素能有效抑制LUAD细胞的恶性行为。

Curcumin-treated LUAD cells retard macrophage M2 polarization

为了探究姜黄素对肿瘤微环境的影响，研究关注了巨噬细胞极化。用PMA诱导THP-1细胞成为M0型巨噬细胞后，用经姜黄素处理的LUAD细胞条件培养基培养。qRT-PCR和流式细胞术结果显示，与未经姜黄素处理的LUAD细胞条件培养基相比，姜黄素处理组的条件培养基能显著降低M2型巨噬细胞标志物(CD206, Arg-1, IL-10, TGF-β)的mRNA表达以及CD163阳性细胞比例。这表明姜黄素能够抑制由LUAD细胞诱导的巨噬细胞向M2型极化。

PPI network construction and core target screening of curcumin in LUAD

为了深入探索姜黄素的作用机制，研究人员进行了靶点筛选。通过分析GSE268175数据集，鉴定了2373个LUAD差异表达基因。从CTD和SwissTargetPrediction数据库获得1152个姜黄素潜在靶点，从GeneCards数据库获得11278个LUAD相关靶点和21589个TAMs相关靶点。将这些基因集与DEGs取交集，得到129个姜黄素在LUAD中的共同作用靶点。构建PPI网络后，利用CytoHubba插件筛选出前10个核心基因，包括CCNA2、CDK1等。鉴于CCNA2在LUAD中高表达且与恶性进展相关，研究选择CCNA2进行后续深入探索。

Functional enrichment analysis of the core targets

对129个共同靶点进行GO和KEGG富集分析。GO分析显示这些靶点主要富集在细胞周期G2/M期转换、炎症反应、蛋白质结合等生物学过程和分子功能上，其中CCNA2富集于G2/M期转换和蛋白质结合。KEGG通路分析表明靶点显著富集于癌症通路、PI3K-Akt信号通路、细胞周期等，CCNA2 specifically enriched in pathways such as Cell cycle, Pathways in cancer, and p53 signaling pathway。

CCNA2 is the target of curcumin

数据库分析(UALCAN, Kmplot)证实CCNA2在LUAD组织和细胞中高表达，且高表达与患者不良预后相关。临床样本检测也验证了CCNA2在LUAD组织中的高表达。分子对接和分子动力学模拟显示姜黄素与CCNA2蛋白具有强烈的结合能力和稳定的结合构象。Western blot实验进一步证实姜黄素处理能降低LUAD细胞中CCNA2的蛋白表达水平。这些结果共同表明CCNA2是姜黄素在LUAD中的作用靶点。

Curcumin hinders the malignant behaviors of LUAD cell lines and macrophage M2 polarization through CCNA2-activated AKT/STAT pathway

为了验证姜黄素是否通过CCNA2发挥作用，研究人员在LUAD细胞中过表达CCNA2(oe-CCNA2)，并同时给予姜黄素处理。结果显示，姜黄素能够逆转CCNA2过表达所促进的细胞增殖、迁移和侵袭，以及所抑制的细胞凋亡。同样，在巨噬细胞极化实验中，姜黄素也能抵消CCNA2过表达对M2极化的促进作用。机制上，姜黄素处理抑制了CCNA2过表达导致的AKT磷酸化(p-AKT)和STAT3磷酸化(p-STAT3)水平的升高，表明姜黄素通过抑制CCNA2激活的AKT/STAT信号通路发挥抗肿瘤作用。

Curcumin curbs the tumor growth with LUAD in vivovia CCNA2

体内动物实验进一步证实了上述发现。在异种移植瘤模型中，与oe-NC组相比，oe-CCNA2组小鼠肿瘤体积和重量显著增加，而oe-CCNA2+姜黄素组则显著抑制了肿瘤生长。IHC染色显示，oe-CCNA2+姜黄素组肿瘤组织中CCNA2和增殖标志物Ki-67的表达明显低于oe-CCNA2组。这表明姜黄素在体内也能通过抑制CCNA2来抑制LUAD肿瘤的生长。

本研究通过多学科交叉的研究策略，首次系统阐明了姜黄素通过直接靶向CCNA2，进而抑制AKT/STAT信号通路，从而遏制LUAD恶性进展和巨噬细胞M2极化的分子机制。这一发现不仅深化了对姜黄素抗癌作用的理解，也为将姜黄素开发成为LUAD的辅助治疗或预防药物提供了坚实的理论依据和实验证据。更重要的是，该研究揭示了CCNA2作为一个新的潜在治疗靶点在LUAD及其肿瘤微环境调控中的重要作用，为未来针对该靶点的药物研发开辟了新方向。这项结合了计算预测与实验验证的研究范式，也为天然产物抗肿瘤机制的探索提供了可借鉴的思路。