循环血浆外泌体miR-146b-5p通过TRAF6/NF-κB信号轴调控脑出血后小胶质细胞介导的神经炎症

《Life Sciences》：Circulating plasma exosomal miR-146b-5p regulates microglial-mediated neuroinflammation through the TRAF6/NF-κB signaling axis after intracerebral hemorrhage

本研究针对脑出血（ICH）后神经炎症调控机制不清的问题，探讨了循环血浆外泌体miR-146b-5p对小胶质细胞极化和神经炎症的作用。结果发现ICH患者血浆外泌体miR-146b-5p显著下调，其通过靶向TRAF6抑制NF-κB通路激活，促进小胶质细胞M2极化并减轻炎症反应，为ICH治疗提供了新靶点。

　　

脑出血（Intracerebral Hemorrhage, ICH）是卒中中最具破坏性的亚型之一，约占所有卒中病例的10%-20%。其特点是脑实质内血管破裂导致出血，不仅死亡率高，而且近年来在年轻人群中的发病率呈上升趋势，给社会带来了沉重的负担。尽管治疗手段不断进步，但能显著改善预后的有效干预措施仍然有限。脑出血后会发生原发性脑损伤和继发性脑损伤（Secondary Brain Injury, SBI），其中继发性损伤是导致预后不良的主要原因。SBI涉及复杂的病理改变，包括神经炎症、血脑屏障破坏和神经毒性脑水肿等，这些过程极大地影响着患者的最终结局。

在这场复杂的病理交响曲中，小胶质细胞（Microglia）作为中枢神经系统内关键的先天免疫细胞，扮演着指挥者的角色。它们是大脑的常驻免疫卫士，在炎症和免疫调节过程中发挥着核心作用。特别是在脑出血后的急性期和亚急性期，神经炎症会通过小胶质细胞的激活、免疫细胞浸润和炎症介质释放而加剧神经元损伤。有趣的是，小胶质细胞在激活后并非铁板一块，它们会迅速极化为两种主要表型：促炎的M1表型和抗炎的M2表型。M1极化的小胶质细胞会释放促炎细胞因子，增加血脑屏障通透性，诱导神经炎症和脑水肿；而M2表型的小胶质细胞则释放免疫抑制物质，从而减轻炎症。因此，减少M1极化、促进向M2表型转换，被认为是缓解继发性脑损伤、改善预后的一个有前景的策略。

近年来，外泌体（Exosomes）——这种由几乎所有细胞类型释放的脂质双分子层包裹的细胞外囊泡——引起了研究人员的极大兴趣。它们能够高效地穿越生物屏障，介导关键的细胞间通讯。作为信号分子和免疫调节剂的载体，外泌体运输着包括蛋白质、脂质、信使RNA（messenger RNA, mRNA）和微小RNA（microRNAs, miRNAs）在内的生物活性成分，从而调节靶细胞的功能。其中，miRNAs作为小非编码RNA，通过与靶mRNA的3‘非翻译区（3’ Untranslated Region, 3‘-UTR）相互作用，抑制翻译或促进mRNA降解，从而在调控基因表达中扮演着重要角色。研究表明，血浆外泌体在疾病诊断和治疗方面具有巨大的应用潜力。例如，循环血浆外泌体miRNA已被报道为啮齿类动物模型中蛛网膜下腔出血和创伤性脑损伤的诊断生物标志物。值得注意的是，有研究发现，血浆外泌体miR-193b-3p可减轻小鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的神经炎症。此外，来自年轻个体的血浆外泌体也显示出治疗相关病理的疗效。这些发现提示，循环系统中的外泌体及其携带的miRNA可能是调控脑出血后病理过程的关键信使。

那么，在脑出血后，循环血浆外泌体中的miRNA谱系会发生怎样的变化？哪些特定的miRNA在其中扮演着关键角色？它们又是通过何种分子机制来影响小胶质细胞的命运，进而调控神经炎症的呢？为了回答这些问题，来自遵义医科大学附属医院的研究团队在《Life Sciences》上发表了一项研究，深入探讨了血浆外泌体来源的miR-146b-5p在脑出血后通过TRAF6/NF-κB信号轴调控小胶质细胞介导的神经炎症的作用机制。

为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术。他们从年轻脑出血患者和健康对照者的外周血中分离血浆，并通过超速离心法提取外泌体，随后利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）和蛋白质印迹法（Western Blot）对其进行了鉴定。通过miRNA测序（miRNA sequencing）和生物信息学分析，他们比较了两组样本中外泌体miRNA的表达差异。在细胞层面，他们使用脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的小鼠小胶质细胞系BV2构建体外炎症模型，并通过转染miRNA模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）以及小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）和过表达质粒（overexpression plasmid）等技术，操控miR-146b-5p及其预测靶点TRAF6的表达水平。在动物层面，他们通过向小鼠纹状体注射自体血建立了脑出血模型，并局部给予miR-146b-5p的激动剂（agomir）或拮抗剂（antagomir）。研究过程中，采用了双荧光素酶报告基因实验（Dual-luciferase Reporter Assay）验证miR-146b-5p与TRAF6的靶向关系；通过定量实时聚合酶链反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR）、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）和免疫荧光（Immunofluorescence）等技术检测基因和蛋白表达、炎症因子水平以及小胶质细胞表型；并通过改良神经功能缺损评分（Modified Neurological Severity Score, mNSS）和转棒实验（Rotarod Test）评估小鼠的神经功能恢复情况。

3.1. 关键血浆来源外泌体miRNAs的鉴定

3.1.1. 血浆外泌体表征和miRNA生物信息学分析

研究人员成功从脑出血患者和健康对照者的血浆中分离出外泌体，并经表征确认其纯度。miRNA表达谱的比较分析显示，脑出血患者来源外泌体（ICH-exo）与健康对照来源外泌体（HC-exo）之间存在显著的差异表达miRNA，其中41个miRNA显著上调，31个miRNA显著下调。基因本体论（Gene Ontology, GO）分析表明，下调的miRNAs富集在核质运输等过程；京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析则提示这些外泌体miRNAs可能通过NF-κB和MAPK等信号通路参与神经炎症过程。

3.1.2. miRNA差异表达的验证

在脑出血中下调最显著的前三个miRNAs（miR-146b-5p, let-7g-5p, miR-155-5p）中，研究人员通过体外实验发现miR-146b-5p模拟物能最显著地减弱LPS刺激的BV2细胞中TNF-α和iNOS的mRNA表达。随后，qRT-PCR验证证实，无论是在脑出血患者还是脑出血模型小鼠的血浆外泌体中，miR-146b-5p的水平均显著低于相应对照组。这些发现确立了miR-146b-5p作为脑出血发病机制中的关键调节因子。

3.1.3. miR-146b-5p在体外抑制M1极化同时促进M2抗炎功能

研究人员通过一系列体外实验深入探究了miR-146b-5p的调控功能。他们发现，转染miR-146b-5p模拟物可以降低M1表型标志物（iNOS, CD86）的mRNA和蛋白表达，同时升高M2表型标志物（Arg1, CD206）的表达，并抑制促炎细胞因子（IL-1β, IL-6, TNF-α）的分泌。相反，转染miR-146b-5p抑制剂则产生相反的效应。免疫荧光结果进一步证实，miR-146b-5p模拟物能显著减少LPS激活的BV2细胞中M1型（iNOS⁺Iba-1⁺）小胶质细胞的比例，同时增加M2型（Arg1⁺Iba-1⁺）细胞的比例。这些结果表明，miR-146b-5p在体外能够驱动小胶质细胞向M2表型极化，并抑制神经炎症。

3.1.4. miR-146b-5p改善脑出血小鼠的神经功能缺损和脑组织损伤

在脑出血小鼠模型中，研究人员在血肿周围区域注射miR-146b-5p的激动剂（agomir）或拮抗剂（antagomir）。结果发现，与脑出血对照组相比，激动剂治疗显著改善了小鼠在第7天时的神经功能评分（mNSS）和转棒实验中的潜伏期，而拮抗剂则加重了神经功能缺损。组织学检查显示，激动剂处理保留了血肿周围区域的神经元结构和尼氏体密度，而拮抗剂则加剧了组织损伤。分子水平上，激动剂能够下调M1标志物、上调M2标志物的表达，并降低促炎细胞因子的水平；拮抗剂的作用则恰恰相反。这些体内实验结果表明，提高miR-146b-5p水平能够促进小胶质细胞M2极化，减轻神经炎症，从而改善脑出血后的神经功能。

3.2. MiR-146b-5p通过靶向作用抑制TRAF6表达

3.2.1. TRAF6是miR-146b-5p调控小胶质细胞表型和神经炎症的关键靶点

为了阐明miR-146b-5p的作用机制，研究人员利用多个生物信息学数据库预测其靶基因，并通过韦恩图分析发现TRAF6是唯一一个被所有五个数据库共同预测的潜在靶基因。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-146b-5p能够直接结合TRAF6 mRNA的3‘-UTR区域，从而抑制其报告基因的活性。进一步的qRT-PCR和蛋白质印迹法分析表明，在LPS刺激的BV2细胞中，miR-146b-5p模拟物能够抑制TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达，而其抑制剂则增强TRAF6的表达。在脑出血小鼠模型中，miR-146b-5p激动剂同样降低了脑组织内TRAF6的表达，拮抗剂则起到提升作用。这些结果确定了TRAF6是miR-146b-5p的直接功能靶点。

3.2.2. miR-146b-5p通过TRAF6/NF-κB信号通路调控小胶质细胞表型转化

考虑到TRAF6是NF-κB信号通路的关键上游调节因子，研究人员推测miR-146b-5p可能通过TRAF6/NF-κB轴来影响小胶质细胞的极化和炎症反应。蛋白质印迹法结果验证了这一假设：在BV2细胞中，miR-146b-5p模拟物或敲低TRAF6均能降低磷酸化NF-κB p65（p-p65）蛋白的水平，抑制NF-κB通路激活；而miR-146b-5p抑制剂或过表达TRAF6则激活该通路。在脑出血小鼠的脑组织中，也观察到了类似的现象。这表明miR-146b-5p通过靶向TRAF6来抑制其下游的NF-κB信号通路。

3.2.3. miR-146b-5p通过恢复TRAF6/NF-κB炎症信号促进M1向M2表型转化

为了最终确认miR-146b-5p的作用是通过TRAF6/NF-κB轴介导的，研究人员进行了挽救实验。他们发现，敲低TRAF6能够模拟miR-146b-5p模拟物的效应，促进M2极化并抑制炎症；而过表达TRAF6则模拟了miR-146b-5p抑制剂的效果。最关键的是，当同时使用miR-146b-5p抑制剂和TRAF6 siRNA时，TRAF6的敲低成功逆转了抑制剂所导致的M1极化增强和NF-κB通路激活效应。这有力地证明，miR-146b-5p对小胶质细胞表型和神经炎症的调控作用，确实是依赖于其对TRAF6的靶向抑制。

综上所述，本研究揭示了循环血浆外泌体miR-146b-5p在脑出血后神经炎症中的关键保护作用。其主要结论是：脑出血后，患者循环血浆外泌体中的miR-146b-5p水平显著降低；恢复或提高miR-146b-5p的水平，能够直接靶向抑制小胶质细胞中TRAF6的表达，进而抑制NF-κB信号通路的激活；这一分子事件的最终结果是促使小胶质细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型极化，减少促炎因子的释放，减轻神经炎症，从而改善脑出血后的神经功能损伤。

这项研究的深刻意义在于，它首次系统地阐明了血浆外泌体miR-146b-5p-TRAF6-NF-κB这一信号轴在调控脑出血后小胶质细胞介导的神经炎症中的作用机制。这不仅深化了我们对脑出血后继发性损伤分子机制的理解，更重要的是，它将循环系统中的外泌体miRNA与大脑内的免疫调控联系起来，为开发新的治疗策略提供了理论依据。miR-146b-5p本身作为一种相对稳定的分子，具有成为疾病诊断生物标志物和潜在治疗靶点的巨大潜力。通过调控这一轴心，未来或许能够通过外泌体递送、miRNA模拟物或靶向TRAF6的药物等手段，精准地调节脑出血后的免疫炎症反应，为改善患者预后带来新的希望。当然，该研究也存在一些局限性，例如体外模型未能完全模拟脑出血的复杂微环境，miR-146b-5p可能存在多靶点效应，患者样本量有限以及其细胞来源尚不明确等，这些都为未来的研究指明了方向。尽管如此，该项工作无疑为攻克脑出血这一临床难题贡献了重要的科学见解。