活细胞中诱导型黏连蛋白环挤压轨迹的特征解析揭示染色质三维组织新机制

《Nature Genetics》：Characterization of induced cohesin loop extrusion trajectories in living cells

本研究开发了TACL（靶向黏连蛋白加载系统），实现了在活细胞特定基因组位点精准诱导黏连蛋白（cohesin）介导的染色质环挤压，揭示了环挤压过程中黏连蛋白复合体与CTCF的互作机制、NIPBL-MAU2的转运特性及其对基因转录的抑制作用，为三维基因组研究提供了创新工具和重要理论突破。

　　

TACL系统

研究团队开发了名为TACL（靶向黏连蛋白加载系统）的遗传学平台，通过将TetR肽与黏连蛋白加载因子MAU2（SCC4）融合，实现可诱导的黏连蛋白招募和环挤压轨迹启动。利用PiggyBac转座子系统，在人类HAP1细胞系中构建了27个随机插入19条染色体的TetO平台。每个平台包含48个TetR结合位点。选择单倍体HAP1细胞可避免未靶向染色体拷贝的干扰。通过慢病毒转导稳定表达TetR-FLAG-MAU2（TACL）或TetR-FLAG-mCherry（Cherry）的细胞系。Western blot显示TetR-FLAG-MAU2主要定位于细胞质，但也能进入细胞核并取代约85%的内源性MAU2蛋白。竞争性替换现象与既往研究一致，因为NIPBL和MAU2的稳定性相互依赖。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）显示，TACL细胞与对照细胞中SMC1和RAD21的分布相似。Hi-C分析表明染色质拓扑结构（包括染色质环、TAD边界和TAD本身）未发生显著改变。新生RNA测序仅发现少量差异表达基因，且细胞增殖速率无显著差异，证明TetR-MAU2可功能性替代内源性MAU2。

TACL招募黏连蛋白复合体至特定基因组位点

通过ChIP-qPCR证实TetR-MAU2和TetR-mCherry能有效结合TetO位点，且结合可被1小时多西环素（Dox）处理逆转。TetR-MAU2（而非TetR-mCherry）能特异性共招募NIPBL至TetO位点，并吸引核心黏连蛋白亚基SMC1和RAD21。ChIP-seq实验进一步验证这些因子在TACL-ON（无Dox）条件下被招募，而在TACL-OFF（+Dox 1小时）条件下消失。STAG1和STAG2的染色质免疫沉淀显示STAG2主要被共加载至TetO位点，这可能源于HAP1细胞中STAG2的RNA表达水平约高5倍。CTCF、PDS5A和WAPL等黏连蛋白相关蛋白未被MAU2招募至TetO位点。

TACL实现局部黏连蛋白环挤压激活

通过4C-seq分析发现，TACL-ON条件下所有TetO位点均形成更多长程接触（>200 kb），并以短程接触减少为代价。TetO平台与周边CTCF位点形成特异性相互作用，跨越数百kb。这些增强的长程接触在Cherry细胞中缺失，并在TACL-OFF细胞中完全解除。隐藏马尔可夫模型（HMM）基于4C信号增益定义了TACL诱导的环挤压域（TACL domains），这些域平均跨越2.56 Mb（最小1.08 Mb，最大4.43 Mb），与已报道的黏连蛋白环挤压范围一致。Hi-C分析显示，TetO位点处出现双向条纹（stripes）而非染色质喷流（jets），表明TACL系统主要支持单向环挤压，可能由于TetR-TetO相互作用的稳定锚定或高浓度黏连蛋白形成的物理屏障所致。

黏连蛋白转运NIPBL-MAU2穿越环挤压轨迹

ChIP-seq显示，TACL依赖的FLAG峰值特异性位于TACL域内。域外MAU2主要与活性增强子相关，而域内MAU2和NIPBL在CTCF位点选择性积累。这些CTCF位点已预存在，在对照细胞中能停滞自然加载的黏连蛋白并共招募PDS5A和WAPL。TACL-ON条件下，黏连蛋白、PDS5A和WAPL在这些位点的结合增加，证明TACL支持黏连蛋白和MAU2-NIPBL从TetO向侧翼CTCF位点的转运。通过构建RAD21-AID降解系统，急性降解RAD21（2小时IAA处理）可解除TACL诱导的拓扑接触，但TetR-MAU2和NIPBL仍被招募至TetO，而在侧翼CTCF位点消失，强烈表明MAU2和NIPBL的积累依赖于与TACL诱导的环挤压黏连蛋白的共迁移。

重新分析ChIP-seq数据发现，在野生型细胞中，NIPBL和MAU2的峰值通常与活性启动子和增强子重叠，但也在许多CTCF位点富集。RAD21降解后，NIPBL和MAU2仍与增强子和启动子关联，但从CTCF位点消失，证明内源性条件下NIPBL-MAU2也由黏连蛋白携带至CTCF位点。共表达V5标记的MAU2实验显示，V5-MAU2虽占据相同位点，但未被招募至TetO或侧翼CTCF位点，未发现体内MAU2交换的证据，与体外研究结果存在差异，可能源于结合动力学差异或染色质环境不同。

黏连蛋白在阻滞性CTCF位点形成交通拥堵

CTCF结合方向性分析显示，主要面向TetO的收敛性CTCF位点有效阻滞环挤压。有趣的是，背向TetO的发散性CTCF位点也积累黏连蛋白。近距离观察发现，TACL诱导的黏连蛋白积累导致多个挤压中的黏连蛋白全酶在CTCF位点前后排队，形成体内黏连蛋白交通拥堵。这种模式表明，挤压中的黏连蛋白复合体在遇到另一个CTCF锚定的暂停黏连蛋白时被阻滞。尽管体外研究显示纯化的凝缩蛋白复合体可在裸露DNA上相互穿越，但体内拥堵现象可能源于环碰撞事件，TACL通过高局部环挤压活性放大了这些滞留事件。

修饰环挤压轨迹长度

通过构建CTCF、WAPL、PDS5A和STAG2的诱导型降解细胞系，研究这些因子缺失对环挤压的影响。WAPL缺失导致局部TetO接触解除，但同时刺激与远端CTCF位点的接触，甚至包括远端发散性位点。PDS5A缺失破坏所有局部TetO接触，但增强与最强远端CTCF位点的连接。STAG2缺失部分 destabilized 局部TetO-CTCF接触，但 cohesin^STAG1更频繁地与远端CTCF位点接触，并沉积更多FLAG标记的MAU2、NIPBL和SMC1，表明cohesin^STAG1具有更高环挤压进程性，在STAG2充足条件下受其他黏连蛋白复合体阻碍。

CTCF位点选择用于染色质环化

通过HMM基于STAG2缺失后的4C-seq接触差异定义坍塌的"内TACL域"和完整的"外TACL域"。域内CTCF位点按ChIP-seq信号强度（强、中、弱）和相对TetO的方向（收敛、发散）分类。TACL主要沉积黏连蛋白于收敛取向的CTCF位点，但发散取向位点也有积累。STAG1异常地更多结合远端（外域）而非近端（内域）CTCF位点，与cohesin^STAG1形成更延伸环挤压轨迹的特性一致。聚合4C分析显示，所有类别的收敛性CTCF位点在TACL-ON条件下均与TetO形成环接触，甚至弱结合位点也参与其中。局部发散性CTCF位点也与TetO形成特异性接触，并积累NIPBL和FLAG标记的MAU2，NIPBL在TetO发散性CTCF位点两侧堆积，进一步证明TACL导致黏连蛋白交通拥堵和环碰撞。

TACL结合环挤压修饰因子缺失

CTCF缺失废除所有CTCF位点与TetO的环化。WAPL缺失引起局部TetO接触解除，但刺激与远端CTCF位点的接触。PDS5A缺失破坏所有局部接触，但增强与最强远端CTCF位点的连接。STAG2缺失部分 destabilized 局部接触，但cohesin^STAG1更频繁地与远端CTCF位点互动。这些结果表明，大多数CTCF位点具有停滞cohesin^STAG2和形成暂时稳定染色质环的能力，复杂CTCF接触网络可存在于接触域内。

高黏连蛋白环挤压活性阻碍转录

通过新生转录组测序（BrU-seq）分析发现，19个有TetO平台整合的活性基因在Dox处理后表达上调。TACL域内非整合基因按与TetO距离分类，距离<250 kb的基因在停止靶向环挤压（Dox添加）后转录平均增加，而TetR-mCherry释放无此效应，表明RNA聚合酶II机械的转录被 bypassing 或暂停的挤压黏连蛋白复合体阻碍。

TACL改变局部染色质可及性和H3K27ac水平

ATAC-seq和组蛋白修饰ChIP-seq分析显示，TACL-ON相比Cherry细胞，H3K27ac峰值中259个丢失、788个获得。丢失位点在TACL域内高度富集，而获得位点无此倾向。H3K27ac信号局部丢失发生在推定增强子而非启动子。多西环素处理1小时不可逆恢复H3K27ac水平。ATAC-seq分析发现仅45和161个位点可及性显著增加和降低，且均在TACL域内富集，不可逆于1小时Dox处理。表明 prolonged 暴露于激活的黏连蛋白环挤压可影响染色质的可及性和表观遗传 landscape，导致H3K27ac水平和调控位点可及性的轻微改变。

讨论

TACL系统支持单向环挤压的可能解释包括：TetR-TetO相互作用的稳定锚定支持单侧环挤压；过量招募的黏连蛋白形成物理屏障；或招募的黏连蛋白先迁移远离TetO，遇到收敛性CTCF屏障后锚定并 reel in 侧翼DNA。研究证明大多数CTCF结合DNA位点能停滞cohesin^STAG2并与其他挤压锚点形成暂时稳定染色质环，这些瞬时稳定事件在野生型细胞因频率低而难以检测。TACL诱导的环挤压对基因表达和H3K27ac水平的负面影响表明挤压机械可影响其穿越染色质的表观遗传构成和基因活性。挤压黏连蛋白与RNA聚合酶转录机械的 encounter 可能阻碍转录，与近期 cohesin 缺失后增强子近端基因上调的观察一致。NIPBL和MAU2在侧翼CTCF位点的TACL诱导积累可能是黏连蛋白在CTCF停滞黏连蛋白后排队的结果，上游和下游排队复合体可能仍携带NIPBL-MAU2。CTCF锚定环形成和稳定可能需要NIPBL和MAU2的持续主动 engagement。TACL实现了时空可控的黏连蛋白环挤压激活，为在体研究个体环挤压轨迹动力学开辟了新途径。