基于Qx5 DNA聚合酶和TthPrimPol的新型等温扩增技术实现高灵敏特异性SARS-CoV-2 RNA检测

《Methods》：Novel primer-less amplification method for detection of RNA molecules

本文报道了一种无需逆转录、无需外加引物的新型等温核酸检测方法。研究人员针对SARS-CoV-2 RNA检测的灵敏度与特异性难题，通过工程化改造phi29 DNA聚合酶获得具有增强3‘-5’外切核糖核酸酶活性的Qx5变体，并结合TthPrimPol引发酶，建立了Padlock探针介导的滚环扩增与超支化扩增联用技术。该方法在37°C条件下即可实现病毒RNA的特异性指数级扩增，对临床样本检测显示出优异性能，为开发低成本、便携式分子诊断平台提供了新策略。

　　

在新冠肺炎全球大流行的背景下，快速、准确、低成本的病毒检测技术成为疫情防控的关键环节。目前主流的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术虽然灵敏度高，但依赖精密仪器和专业操作，难以满足基层医疗和现场检测的需求。特别是面对病毒变异株的不断出现，开发不依赖特定引物、能够直接检测RNA的创新型分子诊断平台显得尤为重要。

传统等温扩增技术如环介导等温扩增(LAMP)需设计多对引物，而滚环扩增(RCA)技术通常需要外加引物启动反应，这些都可能引入非特异性扩增背景。更关键的是，大多数方法需要先将RNA逆转录为cDNA，增加了操作步骤和成本。能否开发一种无需逆转录、无需外加引物，且能在单一温和温度下完成的核酸检测方法，成为分子诊断领域的重要挑战。

发表于《Methods》的这项研究为我们提供了一种创新解决方案。研究团队聚焦于改进基于Padlock探针的检测策略。Padlock探针是一种线性单链DNA分子，当其两端与靶标序列同时杂交时，可通过连接酶环化，形成滚环扩增的模板。传统方法中，启动RCA需要外加引物，而本研究突破性地利用病毒RNA自身的3‘末端作为天然引物，通过精巧的酶学设计实现了检测过程的极大简化。

研究的关键技术方法包括：工程化改造phi29 DNA聚合酶获得Qx5变体；利用Padlock探针靶向SARS-CoV-2 RNA的3‘末端序列；通过SplintR连接酶实现探针环化；建立Qx5介导的RNA引物RCA与TthPrimPol触发的HRCA联用体系；使用25 mM Mg²⁺优化反应条件降低背景；临床验证采用新冠肺炎患者鼻咽拭子提取的RNA样本。

工程化phi29 DNA聚合酶变体Qx5表现出优异的功能特性

研究人员通过对商业化的Qualiphi酶（phi29 DNA聚合酶的热稳定变体）进行理性设计，获得了Qx5变体（携带E218M/V267L/E415K/E416K/E417K突变）。功能表征发现，Qx5不仅保持了phi29 DNA聚合酶固有的链置换活性，还展现出两大突出优势：强大的3‘-5"外切核糖核酸酶活性，能够高效降解RNA-DNA杂交体中的RNA链；改善的聚合酶与外切酶活性协调性。这些特性使其能够直接利用病毒RNA的3‘末端作为引物启动扩增，省去了传统方法中需要添加特异性DNA引物或使用RNase H的步骤。

Qx5实现Padlock探针的RNA引物滚环扩增

研究人员设计了一种靶向SARS-CoV-2 RNA 3‘末端的Padlock探针。当探针与病毒RNA杂交后，其3’末端会形成一段突出的多聚A尾。Qx5的外切核糖核酸酶活性可精确修剪这段尾巴，形成理想的引物末端，进而启动Padlock探针的RCA。实验证明，在37°C、pH 8.8的条件下，Qx5能高效实现这一过程，且严格依赖靶标RNA的存在和Padlock探针的正确环化，显示出高度特异性。

TthPrimPol引发超支化扩增大幅提升检测灵敏度

为进一步提高检测灵敏度，研究人员引入了源自嗜热菌的TthPrimPol引发酶。该酶能在单链DNA上合成DNA引物，当RCA产物（长的单链DNA串联重复序列）形成后，TthPrimPol可在其上合成多个DNA引物，Qx5则延伸这些引物并进行链置换，引发超支化扩增(HRCA)，实现指数级扩增。这一策略将检测信号放大了40倍以上，显著提升了检测灵敏度。

优化反应条件与探针设计确保检测特异性

尽管TthPrimPol的加入大幅提高了灵敏度，但也可能引起非特异性扩增背景。研究团队通过两种策略成功解决了这一问题：将Mg²⁺浓度提高至25 mM，可有效抑制背景扩增而不影响特异性信号；重新设计Padlock探针序列，消除TthPrimPol在线性探针上的优先引物合成位点，同时增加在RCA产物上的优化位点。优化后的检测体系在临床样本验证中，成功区分了SARS-CoV-2阳性与阴性患者样本，且扩增产物量可通过简单的显色反应（中性红指示剂）进行可视化判读。

这项研究成功开发了一种全新的等温核酸检测技术，创新性地结合了工程化DNA聚合酶Qx5和引发酶TthPrimPol的优势，实现了对SARS-CoV-2 RNA的高灵敏、高特异性检测。该方法最突出的特点是无需逆转录步骤和外加引物，大大简化了操作流程，降低了成本和污染风险。通过反应条件和探针序列的优化，有效解决了等温扩增技术常见的特异性难题，为开发低成本、便携式分子诊断平台奠定了坚实基础。

该技术的优势不仅体现在SARS-CoV-2检测方面，更有潜力应用于其他单链RNA病毒（如流感病毒、寨卡病毒等）的检测，以及各种mRNA、非编码RNA的定量分析。特别是在资源有限地区，这种无需复杂仪器、可在单一温度下完成的检测方法，有望显著提升传染病的早期诊断能力。未来，通过进一步整合核酸提取与检测步骤，该技术有望发展成为真正的“样本进-结果出”式诊断设备，为全球公共卫生安全提供有力技术支撑。