综述：非洲猪瘟病毒中宿主-病原体相互作用：免疫逃避和遗传耐药性驱动预防和控制策略

《Microbial Pathogenesis》：Host-pathogen interplay in African Swine Fever Virus: Immune evasion and genetic resistance driving prevention and control strategies

本综述系统探讨了核心-壳层铂银纳米颗粒(Pt@AgNPs)的合成优化及其在抗菌、抗生物膜、抗真菌和抗氧化方面的综合应用潜力。该纳米颗粒通过协同作用增强抗菌活性，对常见病原体如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和大肠杆菌(E. coli)展现出低最小抑菌浓度(MIC)，并能有效抑制生物膜形成和真菌生长，同时具备良好的血液相容性，为应对抗菌素耐药性(AMR)和继发感染提供了创新解决方案。

　　

Abstract

全球医疗保健系统正面临由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病(COVID-19)大流行的沉重负担。免疫抑制疗法与病毒本身固有的免疫抑制能力相结合，显著增加了继发细菌和真菌感染的风险。这些继发感染进一步加剧了医疗资源负担并使患者预后复杂化，凸显了有效应对这些共感染的紧迫性。共感染指多种病原体同时感染，是医疗保健领域的一个关键挑战。它们会加重疾病严重程度、阻碍治疗效果，并加剧抗菌素耐药性(AMR)这一日益严重的问题。共感染中细菌和真菌病原体之间的协同相互作用促进了生物膜形成、增强了病原体存活率并提高了毒力，往往导致更高的发病率和死亡率。One Health方法被定义为医疗保健专业人员为实现人类、动物和环境的最佳健康而进行的协作努力。这种综合方法对于解决日益严重的AMR问题至关重要。AMR源于人类、动物和环境领域抗菌药物的误用和过度使用，导致耐药细菌和耐药基因在这些领域全球范围内扩散。值得注意的是，用于治疗人类细菌感染的许多抗菌药物类别也用于兽医领域，这凸显了在AMR背景下人类和动物健康的相互依存性。此外，畜牧业中预防性使用抗生素也会导致AMR。在环境方面，制药废物和农业径流等因素成为耐药微生物的储存库和传播途径。在AMR日益严峻和现有疗法存在局限性的背景下，迫切需要创新方法来管理这些复杂的感染。

大肠杆菌(E. coli)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(S. aureus)是导致人类和动物继发共感染医疗保健领域挑战不断升级的最普遍细菌病原体。这些生物体也是食源性病原体，并与多种感染相关，如尿路感染、呼吸道感染、皮肤和软组织感染以及败血症，对免疫缺陷个体构成严重的健康风险。其中，铜绿假单胞菌尤其臭名昭著，因为它具有先天的多重抗生素耐药性以及形成生物膜的能力，这显著增强了其存活率和致病性。生物膜形成不仅保护细菌细胞免受宿主免疫系统攻击，而且限制了抗生素的渗透和功效，使得感染异常难以治疗。据说80%的感染是由生物膜形成引起的。这在医疗环境中构成严重问题，铜绿假单胞菌生物膜是慢性感染、医疗器械污染和治疗失败的主要原因。鉴于其临床重要性，靶向生物膜形成是对抗铜绿假单胞菌感染的一个关键方面，因为它导致显著的死亡率。

真菌感染，特别是由黑曲霉(A. niger)引起的霉菌病，进一步加剧了AMR危机。黑曲霉是与皮肤、肺部和尿路感染相关的主要病原体，死亡率高。新的耐药曲霉物种对现有抗真菌药物的出现，凸显了在传统疗法日益失效的情况下对抗真菌感染的创新方法的迫切需求。轮枝镰刀菌(F. verticillioides)是另一种真菌，可在免疫缺陷个体中引起角膜炎和甲癣。镰刀菌病是免疫缺陷人群的一种健康状况，死亡率显著且对抗真菌治疗反应差；因此，迫切需要用于治疗的新型抗真菌剂。曲霉属和镰刀菌属也会引起动物和植物感染。

为解决继发共感染、抗菌耐药性、生物膜形成和抗真菌耐药性问题，纳米颗粒已成为一种有前途的工具。纳米颗粒的抗菌特性依赖于其制备方法，包括使用不同的合成方法、还原剂和封端剂、有效优化各种参数（如浓度、温度、pH值等）以及纳米颗粒的尺寸和形状。在纳米颗粒中，金属纳米颗粒由于其物理化学和内在特性而被广泛探索其抗菌应用。贵金属，包括铂(Pt)、金(Au)、银(Ag)和钯(Pd)，因其抗菌应用而被广泛探索；然而，单金属纳米颗粒的广泛使用受到诸如细胞毒性、不稳定性和大规模生产挑战等问题的限制。这些局限性可以通过使用双金属纳米颗粒来克服，双金属纳米颗粒具有增强的稳定性、降低的细胞毒性和协同抗菌特性。许多类型的双金属系统已被探索其抗菌潜力，例如金@银纳米颗粒(Au@AgNPs)、铜@锌纳米颗粒(Cu@Zn nanoparticles)等。然而，双金属核壳铂银纳米颗粒(Pt@AgNPs)具有铂的催化特性和银的等离子体特性的优势。核壳配置中独特的界面促进了两种金属之间特殊的光学和电子相互作用。为了增强抗菌活性，银（一种有效的抗菌剂）与微生物细胞之间应该有更多的相互作用。因此，铂核改变了银壳的电化学性质和极化，导致更多Ag⁺释放以与微生物细胞相互作用。这导致其比单金属纳米颗粒或其他单金属和双金属纳米颗粒具有更有效的抗菌潜力。

本研究旨在合成和优化核壳Pt@AgNPs，作为一个强大的抗菌、抗生物膜、抗真菌和抗氧化应用平台。选择铂作为核心材料是因为其优异的催化性能、更小的纳米颗粒尺寸和增强的稳定性。此外，铂固有的抗菌特性与其高效的催化活性相结合，有助于熟练地还原银离子，使其成为比金或钯等替代品更理想的核心材料。选择银作为壳材料是因为其有充分证据表明能够退化微生物细胞膜、产生活性氧(ROS)并阻止细胞内过程，使其成为一种有效的抗菌剂。由于形态变化促进了更快的离子溶解，双金属结构通常导致更高的比表面积，从而产生更多具有反应活性的抗菌Ag⁺可用于与微生物细胞相互作用。合成过程经过优化，以实现最大功效，同时确保Pt@AgNPs的稳定性。此外，还进行了抗氧化测定以评估这些纳米颗粒的抗氧化潜力。进一步，评估了Pt@AgNPs在应对抗菌防御、生物膜形成和继发感染挑战方面的潜力。这项研究强调了开发先进的基于纳米颗粒的综合策略以应对AMR方面紧迫的全球健康挑战的重要性。这将为未来作为预防AMR和改善公共、动物和环境健康的综合治疗的临床和医疗应用铺平道路。

Materials

铂前体氯铂酸钾(K₂PtCl₄)购自浦那Sisco Research Laboratory。穆勒欣顿肉汤(MHB)、营养琼脂培养基(NAM)、卢里亚伯特尼(LB)肉汤、结晶紫、刃天青钠、硫酸链霉素、乙酸和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)购自HiMedia, India。硝酸银(AgNO₃)、抗坏血酸、硼氢化钠(NaBH₄)、Triton-X 100、2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-80和所有其他化学品均购自印度本地供应商，均为分析纯级别，无需进一步纯化即可使用。测试微生物，包括细菌（铜绿假单胞菌ATCC 9027、金黄色葡萄球菌ATCC 6538和大肠杆菌ATCC 8739）和真菌（黑曲霉ATCC 16888和轮枝镰刀菌MTCC 1560），从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和微生物培养物保藏中心(MTCC)获得。所有实验均使用超纯水(Millipore, 18.2 MΩ cm)。

Effect of K₂PtCl₄ on core formation

优化各种因素的目的是合成尺寸更大、多分散指数(PDI)更小(<0.3)和Zeta电位更稳定(>30 mV)的铂核。PDI低于0.3表明纳米颗粒的单分散性，并且可以接受将纳米颗粒用于生物医学应用。我们评估了不同浓度的K₂PtCl₄（0.5 mM、1 mM、2 mM和4 mM）以形成最佳的核心铂纳米颗粒(PtNPs)。在0.5 mM、1 mM和2 mM浓度下，流体动力学直径相对较低，分别为约10 nm、12 nm和15 nm。在4 mM浓度下，观察到尺寸显著增加至约25 nm。然而，所有浓度的PDI值均低于0.3，表明纳米颗粒具有良好的单分散性。Zeta电位在所有测试浓度下均保持高度正值（>+30 mV），表明胶体稳定性良好。基于较大的核心尺寸和优异的稳定性，选择4 mM K₂PtCl₄用于后续的壳层沉积步骤。

Conclusion

这项工作证明了Pt@AgNPs的成功优化、合成和详细表征。纳米颗粒经过全面评估以阐明其结构、形态和组成特性，包括尺寸、形状、结晶度和元素组成。优化后的Pt@AgNPs表现出显著的抗菌功效，显示出强大的抗菌、抗生物膜和抗真菌活性。这种增强的抗菌性能可归因于铂核和银壳之间的协同相互作用，导致Ag⁺离子释放增加和活性氧(ROS)生成。此外，纳米颗粒表现出有希望的抗氧化性能和良好的血液相容性，突出了它们作为对抗抗菌素耐药性(AMR)和继发感染的下一代抗菌干预措施的转化潜力。未来的研究应侧重于体内毒性评估、作用机制阐明和规模化生产，以推进其临床应用。

CRediT authorship contribution statement

Niraj Vyawahare: 写作 – 审阅编辑，验证。Pallavi M. Chaudhari: 验证。Bhushan P. Chaudhari: 写作 – 审阅编辑，验证，监督，资源，资金获取，概念化。Sanjana Varma: 写作 – 原稿准备，方法论，形式分析，数据整理。Tejas Subhash Gade: 方法论，数据整理。Shahaji Palaskar: 方法论，数据整理。Koteswara Rao Vamkudoth: 验证，形式分析。Aagam Lalit Bamb: 写作 – 原稿准备，方法论，形式分析，数据整理。

Data availability

支持本研究结果的数据可在本文的补充材料中找到。

Declaration of competing interest

作者声明，他们没有已知的可能影响本报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

Funding sources

本研究未从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何特定资助。

Declaration of Competing Interest

?? 作者声明，他们没有已知的可能影响本报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

Acknowledgements

Aagam Lalit Bamb感谢印度加济阿巴德科学创新研究学院(AcSIR)为其提供M.Tech注册。Sanjana Varma感谢印度加济阿巴德科学创新研究学院(AcSIR)为其提供博士注册，并感谢印度科学和工业研究委员会(CSIR)为其提供奖学金（奖励信编号：31/011(1077)/2019-EMR-I）。