基于分子适配体信标的指数级等温扩增与杂交链式反应联用技术实现microRNA的一锅法无标记检测

《Microchemical Journal》：One-pot, label-free microRNA detection via molecular aptamer beacon-mediated exponential isothermal amplification with hybridization chain reaction

本文开发了一种新型的分子适配体信标（MAB）介导的指数级等温扩增（EXPAR）与杂交链式反应（HCR）联用技术（MABEHCR），用于前列腺癌标志物miRNA-141-3p（miR-141）的高灵敏检测。该方法实现了100 aM的定量限（LOQ），具备优异特异性，且操作简便（单步加样、无需仪器），在1%人血清基质中表现良好，为临床及资源有限地区的床旁诊断（POCT）提供了强大工具。

　　

亮点

材料与试剂

链霉亲和素包被的磁珠（SA-MBs, 1 μm）、20× EvaGreen染料、5× TBE（无DNase/RNase）、10000× SerRed核酸染色剂和预制15%聚丙烯酰胺凝胶分别购自博脉生物技术有限公司（中国无锡）、Biotium公司（中国上海）、武汉赛维尔生物科技有限公司（中国武汉）和碧云天生物技术有限公司（中国上海）。酶及缓冲液，包括克列诺片段（3′→5′ exo-, KF）、Nb.BbvCI切口内切酶、dNTP混合液等均购自美国新英格兰生物实验室公司。所有DNA和RNA寡核苷酸均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。人血清样本采集自吉林医药学院附属医院。所有实验均使用经0.22 μm滤膜过滤的超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）。

MABEHCR系统用于miRNA荧光检测的原理

用于miRNA检测的分子适配体信标介导的指数级等温扩增耦合杂交链式反应（MABEHCR）系统的工作原理如图Scheme 1所示。简而言之，本研究开发的新型miRNA检测系统基于一个多步反应序列，包括：(i) MAB的构象转变，(ii) DNA聚合酶的激活，(iii) 内切酶活性的切口切割，以及(iv) 启动HCR进行信号放大。

结论

在本研究中，我们开发了一种整合了分子适配体信标（MABs）、指数级扩增反应（EXPAR）和无酶杂交链式反应（HCR）的新型miRNA检测策略。该方法对目标miRNA实现了低至100 aM的优异定量限（LOQ），并成功应用于加标到1%人血清中的miRNA检测。与传统的金标准方法相比，该方法展现出显著改善的特异性和灵敏度。