基于脱氧胆酸钠酸沉淀富集策略深度解析小鼠组织S-棕榈酰化修饰组及其在糖尿病脑中的作用机制

《Molecular & Cellular Proteomics》：Enrichment of Cysteine S-palmitoylated peptides using Sodium Deoxycholate Acid Precipitation

本研究针对S-棕榈酰化修饰富集技术复杂、假阳性率高的问题，开发了SDC-ACE（脱氧胆酸钠酸沉淀富集）新方法。该方法利用SDC在酸性条件下共沉淀脂修饰肽的特性，结合DTT选择性还原，实现了高效、特异的S-棕榈酰化肽段富集。研究人员应用该方法绘制了小鼠脑部棕榈酰化修饰图谱，鉴定到33,000余条修饰肽段，揭示了组织特异性修饰规律，并在糖尿病db/db小鼠脑中发现了与胰岛素/瘦素信号通路相关的异常修饰靶点，为代谢性疾病机制研究提供了新视角。

　　

蛋白质翻译后修饰是调控细胞功能的重要机制，其中S-棕榈酰化（S-palmitoylation）作为一种可逆的脂修饰方式，通过将棕榈酸以硫酯键形式共价连接至半胱氨酸残基，动态调节蛋白质的膜定位、稳定性和信号转导功能。然而，由于脂修饰肽段的疏水性强、易与非特异性表面结合，其富集和检测一直面临巨大挑战。传统的酰基生物素交换（ABE）和酰基树脂辅助捕获（Acyl-RAC）等方法操作繁琐，且使用羟胺（HA）作为还原剂时可能非特异性还原二硫键，导致假阳性结果。因此，开发一种高效、特异的S-棕榈酰化富集技术对于深入探索该修饰的生物学功能具有重要意义。

针对这一技术瓶颈，来自南丹麦大学的研究团队在《Molecular & Cellular Proteomics》上发表了创新性研究方法SDC-ACE（Sodium Deoxycholate Acid Precipitation Enrichment）。该方法巧妙利用去垢剂脱氧胆酸钠（SDC）在酸性条件下形成沉淀的特性，使S-棕榈酰化肽段共沉淀从而实现高效富集，并通过二硫苏糖醇（DTT）选择性还原棕榈酰键，显著提高了鉴定的特异性和灵敏度。

研究人员首先通过合成S-棕榈酰化模型肽段验证方法可行性，比较羟胺（HA）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）和DTT的还原效率，发现20 mM DTT能高效特异性还原棕榈酰键而不影响二硫键。随后建立完整技术流程：组织膜蛋白经SDC提取、TCEP还原、N-乙基马来酰亚胺（NEM）烷基化、胰酶消化后，酸性条件下沉淀SDC-肽段复合物，经洗涤后使用DTT释放修饰肽段，最后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。

关键技术方法包括：使用C57BL/6J野生型和db/db糖尿病模型小鼠的组织样本（脑、肝、肾、心、脂肪等），通过碳酸钠提取膜蛋白，SDC溶解后经酶解、酸沉淀、DTT还原等步骤富集修饰肽段，结合TMT标记定量和高pH反相分离技术，利用Orbitrap Astral和Exploris 480质谱平台进行深度检测，数据通过Proteome Discoverer软件进行数据库检索和定量分析。

研究结果主要包括：

1. 1.
   方法学开发：通过合成肽验证显示SDC-ACE能有效富集S-棕榈酰化肽段，DTT还原效率优于传统HA处理，且特异性更高。与Acyl-RAC方法相比，SDC-ACE从500 μg起始材料中鉴定到5,300条独特修饰肽段，灵敏度提升显著。
2. 2.
   小鼠脑S-棕榈酰化组表征：从脑膜蛋白中鉴定到36,125条半胱氨酸肽段，对应6,632个蛋白质，其中81.6%为单半胱氨酸修饰，18.4%为多半胱氨酸修饰簇。生物信息学分析显示修饰蛋白显著富集于突触信号传导、核孔复合体、核糖体、蛋白酶体等关键复合物，提示S-棕榈酰化在蛋白质相互作用和细胞器组织中起重要作用。
3. 3.
   棕榈酰转移酶自身修饰：在所有24种zDHHC蛋白中均发现催化结构域附近半胱氨酸的S-棕榈酰化，这些修饰可能作为棕榈酰基库或参与催化微环境调控。特别是zDHHC6的C328/C329等已知修饰位点被成功验证。
4. 4.
   组织特异性修饰谱：通过多器官比较发现脑组织特异性修饰蛋白集中于突触相关通路，肝脏富集代谢相关蛋白，肾脏主要涉及离子通道蛋白，心脏中与收缩功能相关的蛋白如Ryanodine受体2等呈现特异性修饰。
5. 5.
   糖尿病模型中的修饰调控：在db/db小鼠脑中发现198个显著变化的S-棕榈酰化位点，涉及Ptpn11（SHP-2）、WDFY1、Kcnma1、PI3K p85β、PKC-δ等重要信号分子。其中PKC-δ的C117/C127双位点修饰上调，可能通过影响其膜定位和激活状态参与糖尿病中枢神经炎症调控。

研究结论表明，SDC-ACE方法为S-棕榈酰化研究提供了高效、可靠的技术平台，大幅提升了修饰位点的鉴定深度和准确性。首次系统揭示了小鼠多组织S-棕榈酰化修饰谱，发现该修饰广泛参与核孔复合体组装、信号转导酶调控、代谢通路调节等关键生物学过程。在糖尿病模型中发现的异常修饰靶点，为理解代谢性疾病中脂修饰介导的信号网络失调提供了新机制，也为针对S-棕榈酰化的靶向药物开发提供了理论依据。该技术有望应用于更多疾病模型和临床样本的修饰组学研究，推动蛋白质脂修饰领域的发展。