Egr2依赖性单核细胞源性树突状细胞通过调控免疫抑制性NK细胞增强中性粒细胞介导的抗急性李斯特菌感染保护性免疫的作用机制研究

《Molecules and Cells》：Egr2-dependent Mo-DCs Regulate Immunosuppressive NK cells, Promoting Neutrophil-Mediated Protective Immunity Against Acute Listeria Infection

本研究针对急性细菌感染中树突状细胞（DCs）与其他天然免疫细胞间相互作用机制不清的问题，通过构建CD11c-cre介导的Egr2条件性敲除（Egr2cKO）小鼠模型，结合急性单核细胞增多性李斯特菌（LM）感染模型，揭示了Egr2依赖性单核细胞源性DCs（Mo-DCs）在宿主防御中的关键作用。研究发现，Egr2缺失导致Mo-DCs分化缺陷，单核细胞偏向分化为巨噬细胞（Mo-MACs），后者通过IL-15/IL-15Rα轴促进免疫抑制性CD11blowCD27+TIGIT+ NK细胞扩增，这些NK细胞分泌TGF-β1抑制中性粒细胞（NPs）的NETosis功能，从而增加宿主对LM的易感性。而野生型小鼠中，Mo-DCs来源的TNF-α能增强NPs的NETosis，有效控制感染。该研究首次阐明了Mo-DCs/NK/NPs免疫轴在急性细菌感染天然免疫应答中的核心地位，为相关感染性疾病的治疗提供了新靶点。

　　

当致病菌入侵机体，一场悄无声息的战争便在免疫系统内打响。单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM）作为一种典型的胞内寄生菌，是研究宿主抗细菌感染免疫应答的重要模型。在感染早期，天然免疫细胞是抵御病原体的第一道防线，其中，树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）作为专业的抗原呈递细胞，其重要性不言而喻。然而，在急性细菌感染过程中，不同类型的DCs之间，以及DCs与其他天然免疫细胞（如自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK cells）和中性粒细胞（Neutrophils, NPs））之间如何相互作用、协调作战，从而有效清除病原体，其具体机制尚不清晰。尤其是一种在炎症状态下由单核细胞分化而来的DCs——单核细胞源性树突状细胞（Monocyte-derived DCs, Mo-DCs，也称为炎症DCs或Tip-DCs）——在此过程中的作用更是知之甚少。早期生长反应基因2（Early growth response gene-2, Egr2）是一个锌指转录因子，已知在T细胞、B细胞等的发育和功能中发挥作用，但其在体内DCs发育，特别是Mo-DCs分化及其在细菌感染中的意义，仍是一个待解的谜题。另一方面，关于NK细胞在抗LM感染中的作用存在争议，既有研究认为其具有保护作用，也有报道指出其可能发挥免疫抑制功能，增加宿主易感性。中性粒细胞作为最早到达感染部位的免疫细胞，其通过形成中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）来捕获并杀灭病原体的过程（即NETosis）是清除细菌的关键机制。但何种因素调控NETosis，以及不同免疫细胞间如何通过相互作用影响此过程，是理解抗感染免疫的关键。因此，深入探究Egr2在Mo-DCs分化中的作用，并阐明Mo-DCs、NK细胞和中性粒细胞之间构成的免疫调控网络，对于揭示急性细菌感染的天然免疫防御机制具有重要的科学意义。

为了回答上述问题，研究人员在《Molecules and Cells》上发表了题为“Egr2-dependent Mo-DCs Regulate Immunosuppressive NK cells, Promoting Neutrophil-Mediated Protective Immunity Against Acute Listeria Infection”的研究论文。该研究利用CD11c-cre介导的Egr2条件性敲除（Egr2^cKO）小鼠模型，结合急性LM感染模型、流式细胞术分析、细胞共培养、细胞过继转移、体内细胞耗竭实验以及NETosis检测等多种技术手段，系统地揭示了Egr2依赖性Mo-DCs在抗急性LM感染天然免疫中的核心作用及其调控机制。

本研究应用的关键技术方法主要包括：利用条件性基因敲除技术构建Egr2^cKO小鼠模型；建立急性LM感染小鼠模型以评估体内免疫应答和细菌清除能力；通过流式细胞术对脾脏等组织中的多种免疫细胞（如DCs亚群、NK细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞）进行表型和功能分析；采用体外细胞培养（如Flt3L或GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）培养、单核细胞分化培养）研究细胞命运决定；运用细胞共培养和Transwell体系探究细胞间相互作用；进行体内细胞耗竭（使用特异性抗体清除CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、NK细胞、中性粒细胞或单核细胞）和过继转移实验（将野生型单核细胞过继到Egr2^cKO小鼠体内）以验证特定细胞群体的功能；通过Sytox-Green和髓过氧化物酶（MPO）染色检测中性粒细胞NETosis。实验所用小鼠均在Sungkyunkwan大学（SKKU）的无特定病原体（SPF）设施内饲养。

Egr2^cKO mice are highly susceptible to acute LM infection

（Egr2^cKO小鼠对急性LM感染高度易感）

研究人员首先发现，与野生型（WT）小鼠相比，Egr2^cKO小鼠在亚致死剂量LM感染后脾脏细菌载量显著更高，且在致死剂量感染后存活率显著降低。这表明Egr2缺失导致宿主对LM的防御能力严重受损。进一步对感染小鼠脾脏内天然免疫细胞的分析显示，Egr2^cKO小鼠与WT小鼠在中性粒细胞、单核细胞、NK细胞的总数上无显著差异，但Egr2^cKO小鼠的总DCs群体在感染后期（第3天及以后）显著减少。值得注意的是，在稳态条件下，Mo-DCs未被检测到，而在LM感染后，WT小鼠中出现了Mo-DCs群体，但其在Egr2^cKO小鼠中显著减少。Egr2表达分析显示，其在Mo-DCs中的表达水平显著高于常规DC1（cDC1）和DC2（cDC2），且在其他天然免疫细胞（NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞）中未检测到表达。这些结果提示，Egr2^cKO小鼠对LM感染的高度易感性很可能与DCs，特别是Mo-DCs群体的缺陷有关。

Egr2-dependent Mo-DCs play a crucial role in protective immunity in LM-infected mice

（Egr2依赖性Mo-DCs在LM感染小鼠的保护性免疫中起关键作用）

为了确定是哪个DCs亚群受到影响，研究人员分析了cDC1和cDC2。结果显示，在LM感染过程中，WT和Egr2^cKO小鼠的cDC1和cDC2频率无显著差异。通过Flt3L诱导的骨髓混合培养实验也证实，Egr2缺失并不影响cDC1和cDC2的发育。然而，对Mo-DCs（定义为CD11c⁺MHC-II⁺CD11b⁺F4/80⁺细胞）的分析发现，其在Egr2^cKO小鼠脾脏中的频率在整个感染过程中均显著低于WT小鼠。这表明Egr2特异性调控Mo-DCs的发育，而Mo-DCs的缺失是Egr2^cKO小鼠易感LM感染的主要原因。

Egr2 is an intrinsic factor for Mo-DC development from monocytes

（Egr2是单核细胞向Mo-DC分化的内在因子）

接下来，研究探讨了Egr2是否直接影响Mo-DCs的分化。在GM-CSF诱导的骨髓来源DCs（GM-BMDCs）培养体系中，Egr2^cKO来源的细胞中Mo-DCs群体显著减少，而巨噬细胞（MACs）群体显著增加。在单核细胞体外分化实验中，也观察到同样的趋势：Egr2^cKO单核细胞更倾向于分化为单核细胞源性巨噬细胞（Mo-MACs），而非Mo-DCs。为了在体内验证这一发现，研究人员将CD45.1⁺ WT和CD45.2⁺ Egr2^cKO的单核细胞过继转移到WT受体小鼠中，结果发现，来自Egr2^cKO供体的单核细胞分化成的Mo-DCs显著少于WT供体。骨髓细胞混合培养实验也得出了一致的结果。这些数据强有力地证明，Egr2是单核细胞向Mo-DC分化的一个内在决定性因子，其缺失会导致分化偏向巨噬细胞。

Immunosuppressive NK cells and reduced anti-bacterial NPs increased LM burden in Egr2^cKO mice lacking in Mo-DCs

（Mo-DCs缺失的Egr2^cKO小鼠中免疫抑制性NK细胞和抗菌功能降低的中性粒细胞导致LM负荷增加）

既然Mo-DCs缺失是易感性的关键，那么其下游效应机制是什么？研究人员通过体内抗体耗竭实验评估了不同免疫细胞在抗LM感染中的作用。耗竭CD4⁺或CD8⁺ T细胞对WT和Egr2^cKO小鼠的细菌载量均无影响，表明T细胞在急性LM感染早期并非主要防御力量。耗竭中性粒细胞则导致WT和Egr2^cKO小鼠的细菌载量均显著增加，确认了中性粒细胞是关键的效应细胞。最有趣的是，耗竭NK细胞在WT小鼠中不影响细菌载量，但在Egr2^cKO小鼠中却显著降低了细菌负荷。这表明，在Egr2^cKO小鼠中，NK细胞非但不发挥保护作用，反而表现出免疫抑制特性，加剧了感染。

MAC-derived IL-15 induces immunosuppressive NK cells in Egr2^cKO mice, resulting in higher susceptibility to LM infection

（巨噬细胞来源的IL-15诱导Egr2^cKO小鼠产生免疫抑制性NK细胞，导致对LM感染易感性增高）

那么，Egr2^cKO小鼠中的NK细胞为何会变得免疫抑制？表型分析显示，与WT小鼠相比，Egr2^cKO小鼠脾脏NK细胞中成熟和活化标志物CD11b的表达显著降低，而免疫抑制性标志物CD27和TIGIT（一种抑制性受体）共阳性的NK细胞群体显著增加。将NK细胞与Mo-DCs共培养能显著上调NK细胞CD11b的表达，但这需要细胞间的直接接触。研究人员推测，Egr2^cKO小鼠中增多的Mo-MACs可能是导致NK细胞表型变化的原因。已知巨噬细胞能通过IL-15Rα反式呈递IL-15，而IL-15可诱导TIGIT表达。果然，在Egr2^cKO小鼠感染脾脏中，IL-15Rα⁺的巨噬细胞频率显著高于WT小鼠。体外实验证实，重组IL-15能上调NK细胞的CD27和TIGIT表达。更重要的是，将WT NK细胞与Egr2^cKO来源的巨噬细胞共培养，能诱导出CD27⁺TIGIT⁺免疫抑制性NK细胞群体。因此，Egr2缺失导致Mo-DCs分化缺陷，单核细胞偏向分化为巨噬细胞，后者通过IL-15/IL-15Rα轴驱动了免疫抑制性NK细胞的扩增。

Mo-DC-derived TNF-α stimulates NP-derived protective NETosis in WT mice while TGF-β1 from immunosuppressive NK cells in Egr2^cKO mice inhibit the NETosis

（Mo-DCs来源的TNF-α在WT小鼠中刺激中性粒细胞产生保护性NETosis，而Egr2^cKO小鼠中免疫抑制性NK细胞来源的TGF-β1抑制NETosis）

最后，研究探讨了免疫抑制性NK细胞如何影响关键效应细胞——中性粒细胞的功能。通过Sytox-Green和MPO染色评估NETosis发现，Egr2^cKO小鼠脾脏中性粒细胞的NET形成能力显著低于WT小鼠。体外共培养实验表明，Egr2^cKO来源的NK细胞能显著抑制WT中性粒细胞的NET形成。体内耗竭NK细胞后，Egr2^cKO小鼠的NETosis能力得到恢复。细胞因子分析指向了TGF-β1：Egr2^cKO小鼠感染脾脏中TGF-β1表达升高，且TGF-β1⁺的NK细胞频率显著增加。体外实验中，重组TGF-β1可抑制中性粒细胞NETosis，而在共培养体系中加入抗TGF-β1阻断抗体能逆转Egr2^cKO NK细胞对NETosis的抑制作用。在WT小鼠中，Mo-DCs如何支持中性粒细胞功能？研究发现，将Mo-DCs与中性粒细胞共培养可显著增强NET形成，而这一效应可被抗TNF-α抗体所阻断，表明Mo-DCs来源的TNF-α是激活中性粒细胞NETosis的关键因子。综上所述，在WT小鼠中，Egr2依赖性Mo-DCs通过分泌TNF-α直接增强中性粒细胞NETosis；而在Egr2^cKO小鼠中，Mo-DCs缺失导致免疫抑制性NK细胞扩增，后者通过分泌TGF-β1抑制中性粒细胞功能，最终导致细菌清除失败。

Adoptive transfer (AT) of WT monocytes into Egr2^cKO mice restores the protective immunity against acute LM infection

（过继转移WT单核细胞到Egr2^cKO小鼠可恢复其对急性LM感染的保护性免疫）

为了最终确认Mo-DCs的核心作用，研究人员进行了挽救实验。在WT小鼠中耗竭单核细胞（从而耗竭Mo-DCs的前体）会导致LM负荷显著增加。反之，将WT单核细胞过继转移到Egr2^cKO小鼠后，受体小鼠的细菌载量显著降低，NK细胞上CD11b表达恢复，CD27⁺TIGIT⁺免疫抑制性NK细胞群体减少，中性粒细胞NETosis能力也完全恢复。这些结果完美地证实了Mo-DCs在协调抗LM免疫应答中的不可或缺的作用。

讨论与结论

本研究通过一系列精巧的实验设计，清晰地阐明了Egr2转录因子在急性LM感染天然免疫应答中的核心地位。研究首次揭示Egr2是单核细胞向Mo-DC分化的关键内在决定因子。在Egr2缺失的情况下，单核细胞分化路径偏向巨噬细胞，导致Mo-DCs缺失和Mo-MACs增多。这一细胞命运的转变引发了连锁反应：增多的Mo-MACs通过IL-15/IL-15Rα轴促进免疫抑制性CD11b^lowCD27⁺TIGIT⁺ NK细胞的扩增；这些NK细胞分泌TGF-β1，抑制了关键效应细胞——中性粒细胞的NETosis功能；而本该由Mo-DCs分泌的、能激活NETosis的TNF-α也随之缺失。最终，这条失衡的免疫轴（Mo-DCs缺失 → Mo-MACs增多 → 免疫抑制性NK细胞扩增 → TGF-β1分泌增加 → 中性粒细胞NETosis抑制）导致宿主无法有效清除LM，感染加剧。

该研究的重大意义在于发现并验证了一个全新的天然免疫调控轴——Mo-DCs/NK/NPs轴。它深刻揭示了在急性细菌感染早期，不同类型的天然免疫细胞之间存在着精密的协作与制衡关系。Mo-DCs不仅作为抗原呈递细胞连接天然与适应性免疫，更在此被证明是天然免疫效应网络的核心调控者。研究还解决了关于NK细胞在抗LM感染中作用的长期争议，表明其功能具有上下文依赖性，并明确了其免疫抑制性亚群的特征（CD11b^lowCD27⁺TIGIT⁺）和诱导机制（巨噬细胞/IL-15）。此外，研究明确了中性粒细胞NETosis是抗LM感染的关键效应机制，并揭示了其正（Mo-DCs/TNF-α）、负（免疫抑制性NK细胞/TGF-β1）调控因子。从转化医学角度看，针对Egr2-Mo-DCs通路、免疫抑制性NK细胞或其产生的TGF-β1、或者增强Mo-DCs功能/中性粒细胞NETosis，都可能成为治疗严重细菌感染的新策略。总之，这项研究极大地增进了我们对天然免疫网络复杂性的理解，为感染免疫学领域提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。