皮肤T细胞淋巴瘤恶性亚克隆的异质性、组织趋向性及药物敏感性研究

《Cancer Discovery》：Coexisting malignant subclones with distinct genomic, transcriptional, and ... Open Access

本研究通过单细胞多组学技术揭示白血病性皮肤T细胞淋巴瘤（L-CTCL）普遍存在基因组、转录组和表面蛋白组特征各异的恶性亚克隆。这些亚克隆表现出不同的组织归巢特性、代谢状态和细胞因子表达谱，并对金黄色葡萄球菌（S. aureus）毒素及抗癌药物呈现差异化反应。研究发现，对细菌毒素反应强烈的亚克隆虽更具侵袭性，但在无刺激环境下对药物更敏感，提示通过消除外部刺激可暴露其内在脆弱性，为个体化联合治疗提供了新策略。

　　

引言

白血病性皮肤T细胞淋巴瘤（L-CTCL）是一组预后极差的非霍金淋巴瘤，其特征是恶性T细胞在皮肤和血液中积聚。治疗失败常由耐药癌细胞的进化和发展引起，而严重的细菌感染（尤其是金黄色葡萄球菌感染）是导致高死亡率的主要原因。既往研究表明，基因组不稳定的癌症其内在耐药性可归因于癌细胞群体内的遗传异质性。在L-CTCL中，尽管尚未发现明确的复发驱动突变，但染色体拷贝数变异（CNA）非常常见，且存在显著的转录和遗传异质性。

共存恶性亚克隆的普遍性及其特征

为了在单细胞水平上确定L-CTCL中具有不同基因组和表型特征的共存恶性亚克隆的程度，研究人员对23例L-CTCL患者的外周血单核细胞（PBMC）进行了单细胞T细胞受体（scTCR）和转录组及表位测序（CITE-seq）分析。恶性T细胞表达单克隆TCR，并与其他T细胞分开聚类。在匹配的皮肤活检样本中，发现来自皮肤的恶性细胞表达相同的TCR，并与血液中的恶性细胞共同聚类。

通过单倍型感知的CNA推断结合转录组和表面蛋白组分析来识别恶性亚克隆。研究人员将具有不同CNA谱的亚克隆分为两类：一类在转录空间中呈现不同的聚类（主要亚克隆，命名为A、B、C、D或E），另一类在同一转录簇内混合（次要亚克隆，后缀为.1、.2、.3等）。泛克隆（主干）和亚克隆（分支）CNA通过序列水平的杂合性缺失进行了验证。恶性簇表达相同的TCR序列、非中性CNA、高水平的CTCL相关基因（如TOX和SESN3）和表面标记物（如KIR3DL2和CD307c/FcRL3），以及低水平的CD7和CD26表面蛋白表达，这与CTCL细胞的既定特征一致。

在研究的23例患者中，有20例患者的血液中发现共存亚克隆。为了确定共存亚克隆的存在是否仅限于该队列，研究人员重新分析了来自7个已发表队列的34例额外L-CTCL患者的单细胞数据。所有队列中亚克隆的存在和丰度相似。在57例患者中，有48例（84%）的血液中鉴定出不同的亚克隆，每位患者中位数为3个亚克隆。主要亚克隆占恶性群体的平均比例为75%，但在某些病例中，共存亚克隆的丰度几乎相等。

通过单细胞单倍型感知CNA推断绘制的57例患者的CNA图谱，与之前使用批量DNA测序发表的结果相呼应，验证了亚克隆识别的稳健性。利用单细胞分辨率，研究人员可以识别存在于所有恶性（泛克隆）或亚克隆细胞上的CNA，以及亚克隆水平上CNA事件的分离或互斥。虽然8q（MYC）和17q（STAT3/5）的拷贝数增益以及10q（PTEN/NFKB1）和17p（TP53）的单拷贝丢失通常是泛克隆事件，但chr1、3、4、5和7的染色体增益通常仅存在于患者的部分亚克隆中。同样，1p36（ARID1A）、12p13（CDKN1B）和19p13（ARID3A、TCF3、ZBTB7A）的局灶性单拷贝丢失通常仅在某些亚克隆中检测到。

大多数患者中恶性亚克隆的高丰度以及不同主干和分支CNA的存在强烈表明CTCL中的恶性细胞经历了分支克隆进化。为了验证单细胞CITE-seq数据中单倍型感知CNA推断的结果，研究人员从8例L-CTCL患者（均伴有scTCR+CITE-seq数据）的PBMC中分选了匹配的恶性（肿瘤）和非恶性（正常）细胞，并使用全外显子组测序（WES；5例患者）和全基因组测序（WGS；3例患者）分析了匹配的肿瘤/正常样本。从恶性细胞的批量DNA测序中调用CNA验证了绝大多数推断的CNA事件，包括占恶性群体15%以上的亚克隆事件。对于PT03和PT13，根据CITE-seq鉴定的表面标记物将恶性细胞分选成不同的亚克隆，并分别对每个亚克隆样本进行WGS分析。这些数据验证了亚克隆CNA事件，并阐明除了亚克隆CNA外，亚克隆还通过较小的遗传事件（如单核苷酸变异（SNV）和插入/缺失（indel））来区分，这些变异并非所有亚克隆共享，占PT03和PT13中发现的高置信度体细胞变异的50%和60%。这证实了亚克隆已经发生了不可逆的功能性分化，并支持了亚克隆可以共存较长时间的观察结果。

恶性亚克隆在组织趋向性、空间分布和细胞因子表达方面的差异

在几位患者中，血液中的主要亚克隆（按定义命名为A.1，标记为红色）并非匹配皮肤中的主要亚克隆。为了确定亚克隆是否在组织归巢偏好上表现出差异，研究人员比较了一系列对归巢和滞留于皮肤或淋巴组织（骨髓或淋巴结）重要的受体和整合素的表达。确实，当比较每位患者内表达最高和最低的亚克隆时，超过三分之一的患者其共存亚克隆在涉及皮肤或淋巴组织特异性归巢和滞留的基因表达上存在两倍以上的差异。

比较来自8例患者匹配血液和皮肤的恶性亚克隆证实，虽然一些患者在两个组织区室中显示出相似的亚克隆分布，但其他患者显示出显著差异，包括在某些区室中高度富集或几乎完全耗尽的亚克隆。为了确定亚克隆差异是病变特异性而非组织特异性，研究人员使用scTCR+CITE-seq分析了来自另外三例患者的匹配血液和来自两个独立病变的皮肤。为了解读皮肤内的空间背景和亚克隆对特定微环境的偏好，研究人员进一步将皮肤活检组织分离为真皮和表皮。亚克隆分布在血液、真皮和表皮中高度不同，但在独立病变之间显示出显著的相似性，即使是两个临床表现高度不同的病变（红皮病和斑块）。这证实了亚克隆差异是由于组织特异性归巢和滞留偏好，而非随机病变差异。有趣的是，一些亚克隆仅存在于表皮中，而其他亚克隆仅存在于血液和真皮中，表明亚克隆可能在其偏好的组织生态位上存在差异。

皮肤区室趋向性与不同归巢/滞留标记物在mRNA和蛋白质水平的表达相关。这包括在某个区室内所有亚克隆均表达的标记物（组织印记，如皮肤趋向性的CD69；表皮趋向性的ITGAL、ITGB2和RUNX1），以及其他在不同组织区室间亚克隆稳定差异的标记物（如CCR4、CCR6、CD49a和ITGAE/CD103）。例如，亚克隆PT09.A在血液和真皮中均表达CCR4和淋巴趋向性基因（S1PR1、CCR7和SELL），表明该亚克隆比其他亚克隆更具迁移性，这与其在血液中的优势地位一致。CCR4仅由PT09.A表达，而皮肤驻留亚克隆PT09.B和PT09.C不表达，进一步表明CCR4可能主要用于初始皮肤归巢，随后丢失。在某些皮肤驻留亚克隆中CCR4的丢失在其他（但非所有）患者中也观察到。

既往研究表明，与匹配的血液相比，L-CTCL患者皮肤中的恶性细胞在存在于皮肤时表现出更高程度的激活和细胞因子产生。相应地，研究人员分析了匹配血液和皮肤样本患者中细胞因子的表达。研究发现，除了皮肤中相较于血液整体表达更多细胞因子（如IFNG）外，许多细胞因子在不同组织区室间也表现出亚克隆差异，包括许多与CTCL相关的细胞因子，如IL2、IL4、IL10、IL13、IL21和IL22。综上所述，这表明共存恶性亚克隆进化得在功能和空间上截然不同，与 divergent evolution（ divergent evolution）过程一致。

恶性亚克隆在代谢、细胞间信号传导方面的差异

为了确定亚克隆间的功能差异是其 divergent evolution 表型固有的，还是由其不同的组织特异性区室偏好所印记的，研究人员比较了每位患者血液中共存亚克隆的转录组。通过通路富集分析，发现在超过50%的拥有多个亚克隆的48例患者中，共存亚克隆之间存在一系列通路存在固有差异激活。这些通路在某些类别中尤其富集，包括代谢、信号转导、对刺激的细胞反应以及免疫相关通路，包括细胞因子和TCR–NF-κB信号轴。类似的通路富集差异在皮肤中共存亚克隆之间也观察到。这表明在L-CTCL中，恶性亚克隆的 divergent evolution 倾向于产生在基线代谢以及从其周围组织微环境接收和处理信号的能力方面存在差异的亚克隆。

为了验证这一点，研究人员量化了11例L-CTCL患者（其皮肤病变中有恶性亚克隆作为相互作用的接收方）皮肤病变内的潜在细胞间相互作用。在所有样本中，真皮和表皮中的树突状细胞，以及真皮中的成纤维细胞和内皮细胞，是皮肤中恶性亚克隆配体的主要贡献者。通过量化每个共存亚克隆的总相互作用权重，研究发现不同的亚克隆始终表现出与其微环境相互作用的差异潜力，并且皮肤中总相互作用权重高的亚克隆通常并非在血液区室中占主导地位的亚克隆（按定义，亚克隆A是血液中最常见的亚克隆）。重要的是，研究发现具有高潜力从其微环境接收信号的亚克隆也表现出更高频率的MKI67阳性细胞，表明外部信号可能诱导这些亚克隆增殖。

恶性亚克隆对金黄色葡萄球菌及其毒素的差异化反应

如上所述，每位患者内的共存亚克隆在其基线代谢和信号转导方面表现出差异，包括涉及对外部因素（如TCR和细胞因子信号传导）反应的通路，这些通路在金黄色葡萄球菌感染如何助长癌症中起着重要作用。这促使研究人员确定共存亚克隆是否对金黄色葡萄球菌感染的存在有不同的反应。

为了验证这一点，研究人员在来自L-CTCL患者PT17的血液细胞存在的情况下，培养了来自从L-CTCL患者病变皮肤分离的活金黄色葡萄球菌菌株的培养上清液，或来自同一菌株但经过特异性溶菌内溶素处理的培养上清液。通过流式细胞术分析共存的亚克隆（通过CITE-seq鉴定的差异表面标记物表达区分）在培养3天后的激活（母细胞化和CD25诱导）。与亚克隆对细胞因子和TCR–NF-κB轴反应不同的情况一致，研究人员发现暴露于活金黄色葡萄球菌上清液的共存亚克隆在激活方面存在显著差异。用金黄色葡萄球菌特异性溶菌内溶素处理细菌后，激活被完全消除。

为了确定金黄色葡萄球菌暴露引起的不同亚克隆激活是否由已知能激活CTCL中恶性T细胞的葡萄球菌肠毒素（SE）介导，研究人员分析了另一例L-CTCL患者PT14的血液细胞在存在或不存在产生SE的金黄色葡萄球菌培养上清液的情况下的额外培养物。仅当上清液中含有SE时才能观察到恶性亚克隆的激活，并且当负责介导TCR信号传导的近端Src激酶被A-419259药理抑制时，激活被完全消除，证实了SE以TCR依赖性方式诱导恶性T细胞激活。值得注意的是，在同一患者中，两个主要共存亚克隆中只有一个在存在产生SE的金黄色葡萄球菌时出现细胞大小母细胞化反应并诱导增殖。在另外七例L-CTCL患者中证实SE足以诱导共存亚克隆的选择性激活。

为了确定对金黄色葡萄球菌反应的亚克隆差异是由于反应动力学、幅度还是质量（如诱导的细胞过程通路）的差异，研究人员在存在或不存在SE的情况下培养了六例L-CTCL患者的血液细胞，并在4、24、48、72和144小时后使用scTCR+CITE-seq分析亚克隆反应。研究发现共存亚克隆在反应幅度上（以整体转录变化衡量）存在差异，这在所有时间点基本一致，尽管在六例患者中的两例（PT03和PT11）中也发现了亚克隆反应动力学的差异。为了评估共存亚克隆是否在反应质量上不同，研究人员在转录反应峰值（36-72小时）时，用来自另外10例L-CTCL患者的血液扩展了数据集，这些细胞在存在或不存在SE的情况下培养。由SE在恶性亚克隆中诱导的差异表达基因进行的通路分析产生了具有不同通路激活的四个亚克隆簇（称为SE反应组）。与亚克隆反应的质量差异一致，研究发现来自同一患者的共存亚克隆通常出现在不同的SE反应组中。SE反应组在其TCR诱导和激活诱导的表面标记物的上调以及诱导的增殖方面表现出不同的模式。有趣的是，研究人员在基线离体状态下识别出属于不同SE反应组的亚克隆的转录特征，其中包括几个与T细胞和/或癌症生物学相关的基因。综上所述，数据表明共存恶性亚克隆对金黄色葡萄球菌及其毒素的反应在质量上不同，可能在这些患者发生金黄色葡萄球菌感染后为某些亚克隆提供选择性优势并增加其侵袭性。

外部诱导的侵袭性与内在耐药性的亚克隆差异关联

对于L-CTCL患者，治疗反应通常是短暂的，治疗耐药的发展是一个常见问题。研究人员调查了亚克隆对癌症治疗的敏感性是否与其对外部因素（如金黄色葡萄球菌）的反应性相关。

相应地，研究人员用罗米地辛（一种临床批准的用于CTCL的组蛋白去乙酰化酶抑制剂）处理L-CTCL患者PT17的血液细胞，并使用流式细胞术测量细胞死亡的诱导。有趣的是，虽然非恶性CD4⁺ T细胞和亚克隆B在很大程度上不受治疗影响，但主要亚克隆A的活力和细胞数量显著降低。罗米地辛反应的差异在转录水平上已经很明显，在36小时后，亚克隆A与亚克隆B和非恶性CD4⁺ T细胞相比，表现出质量不同且更强的整体转录反应。有趣的是，被罗米地辛有效消除的亚克隆A，也是在金黄色葡萄球菌暴露后激活和增殖最强烈的亚克隆。

这促使研究人员调查是否能根据亚克隆所属的SE反应组发现一致的治疗反应差异。研究人员用六种用于治疗CTCL或已被证明能杀死CTCL患者恶性细胞的抗癌药物处理了12例L-CTCL患者的血液细胞，这些患者的恶性亚克隆来自不同的SE反应组，并可通过流式细胞术鉴定。有趣的是，研究发现来自不同SE反应组的恶性亚克隆对癌症药物的反应不同，并且显示出最高激活和增殖的SE反应组（第3组）往往也是对所有研究药物最敏感的组之一。研究人员还发现SE反应组在其用于CTCL治疗或正在研究的生物制剂靶点的表达上存在差异。罗米地辛反应的亚克隆差异在多个独立重复和个体患者的多次采样中是一致的。最近一项研究表明，金黄色葡萄球菌的存在可以通过TCR–NF-κB依赖性通路诱导L-CTCL患者恶性细胞的治疗耐药。确实，研究发现虽然SE反应组3中的亚克隆在本质上对治疗最敏感，但当治疗期间存在SE时，这些亚克隆对罗米地辛完全耐药。亚克隆激活和诱导耐药的差异不仅限于SE，也可以由其他外部炎症因素诱导，如IL-2家族细胞因子和另一种超抗原毒素（化脓性链球菌外毒素C）。与之前的结果一致，SE诱导的耐药在对已知能抑制NF-κB信号的硼替佐米的反应中未观察到。重要的是，上述分析中包括的所有患者均未接触过六种研究中的抗癌药物；因此可以排除获得性耐药的参与。因此，尽管反应性恶性亚克隆在存在外部因素时更具侵袭性，但代价是当刺激被移除时，它们本质上对癌症治疗也更敏感。

讨论

L-CTCL由于快速发展的治疗耐药以及频繁且可能致命的感染（尤其是金黄色葡萄球菌感染）而导致预后极差。本研究表明，L-CTCL患者携带多个不同的亚克隆，这些亚克隆在多个组织区室和各种治疗方案下共存较长时间。研究发现共存亚克隆在其基线代谢和信号转导方面存在差异，包括涉及对外部因素（如TCR和细胞因子信号传导）反应的通路，这些通路在金黄色葡萄球菌感染如何助长癌症中起着重要作用。使用金黄色葡萄球菌上清液和纯化的肠毒素，研究人员验证了在几位患者中，共存亚克隆在其激活、转录和增殖反应方面存在显著差异。确实，根据其对SE的转录反应，亚克隆可以分为不同的功能类别，这些类别在其侵袭性和增殖反应方面表现出明显差异。值得注意的是，研究发现对SE表现出最强增殖反应的亚克隆也对一系列癌症药物最敏感——其中几种是临床批准用于治疗CTCL的。这表明恶性细胞响应外部因素（如细菌毒素和细胞因子）的能力与其内在治疗敏感性之间可能存在直接联系。因此，尽管癌细胞保留响应环境的能力（导致增殖增加和侵袭性增强）是有利的，但代价是对治疗更敏感。在临床环境中，这种弱点很可能被金黄色葡萄球菌感染和炎症环境的存在所抵消，这两者都是这些亚克隆中强效的耐药诱导剂。重要的是，诱导的耐药性取决于刺激的持续存在，并通过其移除而被抵消。因此，研究结果强调，通过靶向细菌感染和抑制炎症环境，可以暴露恶性亚克隆的弱点，否则这些弱点难以治疗。

研究表明共存恶性亚克隆在其组织趋向性和皮肤内空间定位方面存在差异。确实，在患者血液中不常见或缺失的亚克隆可能在特定的皮肤区室（如表皮）中高度丰富。通过分析同一患者的多个病变，研究人员证实这是由于亚克隆皮肤区室趋向性的固有差异，而非单一采样所致。此外，尽管血液中最丰富的亚克隆通常也可以在皮肤病变中发现，但该亚克隆与其他共存亚克隆相比，往往具有更少的细胞间相互作用能力，这反过来又与其在皮肤中增殖活性降低相关。总的来说，长时间共存的亚克隆的高丰度支持了分支进化模式。这些亚克隆表现出不同的功能能力并栖息于不同的空间生态位或组织区室，表明亚克隆已经分化并适应了在不同条件和生态位下持续存在，而不是直接相互竞争，有效地将L-CTCL的亚克隆进化定义为 divergent evolution。先前针对蕈样肉芽肿的研究也表明，分支进化可能是CTCL中导致恶性亚克隆的主要途径。然而，在这些研究中，亚克隆是通过每个亚克隆携带不同的TCR序列重组来识别的，表明CTCL中恶性转化是胸腺前起源的。在本研究分析的样本中，每位患者的共存恶性亚克隆总是共享一个共同的TCR克隆型，并且研究人员在这些患者中未检测到任何具有恶性CNA或恶性基因/蛋白表达谱的次级T细胞克隆（具有不同TCR）。这种差异可能是由于两种疾病实体（蕈样肉芽肿和L-CTCL，主要是Sézary综合征）的生物学差异，但也可能部分归因于使用批量WES与单细胞方法的技术差异。

本研究的一个局限性是使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和推断的CNA进行亚克隆识别。这种方法的选择排除了基于小插入缺失以及SNV识别恶性亚克隆的可能性。实际上，这意味着每位患者估计的亚克隆数量是保守的，并且由较小遗传事件定义的次要亚克隆可能比此处报道的要多。然而，通过利用本研究中亚克隆之间的转录差异，研究人员可以区分具有功能性下游后果的基因组驱动事件与否则在转录上静止的乘客事件，而这使用传统的基于DNA的批量检测方法是无法实现的。对于一部分患者，研究人员使用全基因组DNA测序验证了推断的CNA以及恶性亚克隆之间的遗传和基因组差异，并表明亚克隆CNA伴随着大量亚克隆插入缺失和SNV的积累，证实了亚克隆已经发生了不可逆的功能性分化，并且可以共存较长时间。

研究表明反应性恶性亚克隆往往在皮肤中更丰富，而反应性较弱的亚克隆在匹配的L-CTCL患者血液样本中更常见。结合这些亚克隆在体外的治疗敏感性和抗体治疗靶点差异表达，这一发现为不同治疗方案在受CTCL影响的不同区室（如皮肤、血液和淋巴结）中实现快速和有效反应方面表现出显著差异提供了解释。例如，尽管体外光分离置换法和维布妥昔单抗清除皮肤区室的速度比血液中观察到的要快得多，但在用莫格利珠单抗或阿仑单抗（分别靶向和消除表达CCR4或CD52的细胞）治疗患者时观察到相反的情况。确实，据报道莫格利珠单抗和体外光分离置换法的联合治疗优于任一单独治疗。这突显了绘制患者的亚克隆图谱——以及不同亚克隆对其外部环境和癌症药物的反应——可能是为患者量身定制合理联合治疗的第一步，并在出现继发性治疗耐药时为下一线治疗选择提供新的机会。

总之，研究表明大多数L-CTCL患者携带多个遗传上不同的恶性T细胞亚克隆，这些亚克隆对外部因素和癌症药物的反应不同。这些发现表明亚克隆的 divergent evolution 增强了癌细胞群体整体的适应性、侵袭性和耐药性。对高度复杂的特化癌亚克隆网络的发现为这种T细胞癌症的侵袭性疾病进程和治疗耐药提供了新的解释。研究结果还表明，持久有效的治疗以及最终的治愈将依赖于完整的亚克隆图谱绘制，以指导新的联合治疗，从而协同靶向给定患者中的所有癌亚克隆。