恶性亚克隆的异质性驱动皮肤T细胞淋巴瘤的适应性、侵袭性与耐药性

《Cancer Discovery》：Malignant subclones exhibit differences in their tissue homing, spatial nic... Open Access

本文揭示了白血病性皮肤T细胞淋巴瘤（L-CTCL）中普遍存在多个具有独特基因组、转录组和表面蛋白组特征的恶性亚克隆。这些亚克隆表现出组织归巢、空间分布、细胞因子表达、代谢及对金黄色葡萄球菌（S. aureus）毒素和抗癌药物反应的显著差异。研究证实，尽管细菌毒素可选择性激活特定亚克隆，但这些高反应性亚克隆在无刺激时对药物最敏感。这种恶性亚克隆的趋异进化（divergent evolution）通过将关键特征（如侵袭性和耐药性）分配于不同亚克隆，增强了整体癌细胞的适应性与耐药性，同时也暴露了可被个体化联合疗法利用的内在脆弱性。

　　

恶性亚克隆的异质性驱动皮肤T细胞淋巴瘤的适应性、侵袭性与耐药性

摘要

药物耐药性癌细胞的演变和过度生长是治疗失败的常见原因。白血病性皮肤T细胞淋巴瘤（L-CTCL）患者因产生耐药性和严重细菌感染而预后不良。本研究显示，大多数L-CTCL患者携带多个遗传学上截然不同但表达相同克隆性抗原受体的恶性亚克隆。这些共存的恶性亚克隆在组织归巢、代谢、细胞因子表达以及对金黄色葡萄球菌（S. aureus）毒素和抗癌药物的反应方面存在差异。重要的是，尽管金黄色葡萄球菌毒素选择性增强某些亚克隆的活化和增殖，但这些反应性亚克隆在刺激物移除后也对抗癌药物最敏感。因此，恶性亚克隆的趋异进化（divergent evolution）驱动了侵袭性、适应性和耐药性，但通过移除外部刺激并绘制恶性亚克隆图谱，我们可以暴露其内在脆弱性，用于癌症治疗。

引言

皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）是一组异质性的非霍奇金淋巴瘤，其特征是恶性T细胞在皮肤中积聚。晚期疾病包括白血病性CTCL（L-CTCL），如Sézary综合征，预后极差，其特征是快速产生或预先存在原发性治疗耐药。尽管尚未确定复发性驱动突变，但复发性染色体拷贝数畸变（CNA）很常见，尤其是在L-CTCL中，并且多项研究描述了显著的转录和遗传异质性。金黄色葡萄球菌感染在晚期CTCL中常见，是发病和死亡的主要原因。恶性细胞产生的细胞因子可能诱导皮肤屏障缺陷，作为细菌的入侵点。反过来，金黄色葡萄球菌的存在通过分泌毒素为恶性细胞提供燃料，这些毒素调节抗肿瘤反应，创造有利的肿瘤微环境，并直接诱导恶性细胞的增殖、持续存在和耐药性。

结果

共存恶性亚克隆在L-CTCL患者中常见且具有独特的基因组、转录组和表面蛋白组特征

为了在单细胞水平上确定L-CTCL中共存恶性亚克隆的程度，研究人员使用单细胞T细胞受体和转录组及表位索引测序（scTCR+CITE-seq）分析了23名L-CTCL患者的外周血单核细胞（PBMC）。恶性T细胞表达单克隆TCR，并与其他T细胞分开聚类。对于同时分析了匹配皮肤活检的样本，发现来自皮肤的恶性细胞表达相同的TCR，并与来自血液的恶性细胞共同聚类。使用单倍型感知的CNA推断结合转录组和表面蛋白组分析来识别恶性亚克隆。根据它们是否在转录空间中表现出不同的聚类，将具有不同CNA谱的亚克隆分为两类：主要亚克隆和次要亚克隆。全克隆和亚克隆CNA在序列水平上通过杂合性缺失进行了验证。恶性簇表达相同的TCR序列、非中性CNA、高水平的CTCL相关基因和表面标志物，以及低表面蛋白表达，与CTCL细胞的既定特征一致。

在23名患者队列中，有20名患者的血液中发现了共存亚克隆。为了确定共存亚克隆的存在是否仅限于我们的队列，研究人员重新分析了来自七个已发表队列的34名额外L-CTCL患者的单细胞数据。所有队列中亚克隆的存在和丰度相似。在57名患者中，有48名患者的血液中发现了不同的亚克隆，每位患者中位数为三个亚克隆。主要亚克隆占恶性群体的平均75%，但在某些情况下，共存亚克隆的丰度几乎相等。

57名患者的CNA图谱使用单细胞单倍型感知CNA推断，反映了先前使用批量DNA测序发表的结果，验证了我们亚克隆识别的稳健性。利用单细胞分辨率，我们可以识别存在于所有恶性或亚克隆细胞上的CNA，以及在亚克隆水平上CNA事件的分离或互斥。尽管8q、17q的拷贝数增加以及10q、17p的单拷贝丢失通常是全克隆事件，但chr1、3、4、5和7的染色体增加通常仅存在于患者的某些亚克隆中。同样，1p36、12p13和19p13的局灶性单拷贝丢失通常仅在某些亚克隆中检测到。

大多数患者中恶性亚克隆的高丰度以及不同的主干和分支CNA的存在强烈表明CTCL中的恶性细胞经历了分支克隆进化。为了追踪亚克隆的演变，研究人员在11名L-CTCL患者的各种治疗期间跨多个时间点分析了亚克隆的存在。重要的是，亚克隆的核心转录和表面蛋白表达在不同时间点基本保持恒定。这使得我们能够使用流式细胞术以更高的时间分辨率跟踪额外患者血液中的亚克隆演变。最后，在具有匹配血液和皮肤活检的患者样本中，我们发现皮肤中存在类似的亚克隆异质性，并且同一病变的多个活检中亚克隆丰度一致。

为了验证我们从CITE-seq数据中单倍型感知CNA推断的结果，研究人员对8名L-CTCL患者的PBMC中分选的匹配恶性细胞和非恶性细胞进行了分析，并使用全外显子组测序和全基因组测序分析了匹配的肿瘤/正常样本。从恶性细胞的批量DNA测序中调用CNA验证了绝大多数推断的CNA事件，包括占恶性群体15%以上的亚克隆事件。对于两名患者，我们根据CITE-seq鉴定的表面标志物将恶性细胞分选成不同的亚克隆，并分别对每个亚克隆样本进行了WGS。这些数据验证了亚克隆CNA事件，并阐明除了亚克隆CNA之外，亚克隆还通过较小的遗传事件（如单核苷酸变异和插入/缺失）来区分，其中不共享于所有亚克隆的变异占在这些患者中发现的高置信度体细胞变异的很大比例。这证实了亚克隆已经不可逆地且功能性地分化，并支持了我们观察到的亚克隆可以共存较长时间的结论。

恶性亚克隆在组织特异性归巢特性、空间分布和细胞因子表达方面存在差异

在几名患者中，血液中的主要亚克隆并不是匹配皮肤中的主要亚克隆。为了确定亚克隆是否在组织归巢偏好上存在差异，研究人员比较了与归巢和滞留于皮肤或淋巴组织相关的多种受体和整合素的表达。当比较每位患者中表达最高和最低的亚克隆时，超过三分之一的患者其共存亚克隆在与皮肤或淋巴组织特异性归巢和滞留相关的基因表达上存在两倍以上的差异。比较来自8名患者的匹配血液和皮肤的恶性亚克隆证实，尽管一些患者在两个组织区室中显示出相似的亚克隆分布，但其他患者显示出巨大差异，包括在某些区室中高度富集或几乎完全耗尽的亚克隆。为了确定亚克隆差异是病变特异性而非组织特异性，研究人员使用scTCR+CITE-seq分析了来自三名额外患者的匹配血液和两个独立病变的皮肤。为了破译皮肤内的空间背景和亚克隆对特定微环境的偏好，我们进一步将皮肤活检分离为真皮和表皮。亚克隆分布在血液、真皮和表皮中高度不同，但在独立病变之间显示出显著的相似性，即使对于两个具有高度不同临床表现的病变也是如此。这证实了亚克隆差异是由于组织特异性的归巢和滞留偏好，而非随机的病变差异。有趣的是，一些亚克隆仅存在于表皮中，而其他亚克隆仅存在于血液和真皮中，表明亚克隆可能在其偏好的组织生态位方面存在差异。皮肤区室趋向性与不同的归巢/滞留标志物的表达相关，包括在某个区室中所有亚克隆均表达的标志物，以及其他在不同组织区室间稳定差异的标志物。

我们和其他人已经表明，与匹配的血液相比，当存在于L-CTCL患者的皮肤中时，恶性细胞表现出更高程度的活化和细胞因子产生。因此，我们分析了具有匹配血液和皮肤样本的患者中细胞因子的表达。我们发现，除了皮肤中比血液中表达更多细胞因子外，许多细胞因子在不同组织区室间也表现出亚克隆差异，包括许多与CTCL相关的细胞因子。总之，这表明共存的恶性亚克隆在功能上和空间上已经进化得截然不同，与趋异进化过程一致。

共存恶性亚克隆在代谢和细胞间信号传导方面存在差异，包括细胞因子和TCR–NF-κB轴

为了确定亚克隆之间的功能差异是否是其趋异进化表型所固有的，而不是由其不同的组织特异性区室偏好所印记的，我们比较了每位患者血液中共存亚克隆的转录组。通过通路富集分析，我们发现超过50%的携带多个亚克隆的48名患者中，其共存亚克隆之间存在一系列通路存在差异激活。这些通路在特定类别中尤其富集，包括代谢、信号转导、对刺激的细胞反应以及免疫相关通路，包括细胞因子和TCR–NF-κB信号轴。在皮肤中共存的亚克隆之间也观察到类似的路径富集差异。这表明在L-CTCL中，恶性亚克隆的趋异进化倾向于产生在基线代谢以及从其周围组织微环境接收和处理信号的能力方面存在差异的亚克隆。为了验证这一点，我们量化了11名L-CTCL患者的病变皮肤内潜在的细胞间相互作用，这些患者的恶性亚克隆处于相互作用的接收端。在所有样本中，真皮和表皮中的树突状细胞，以及真皮中的成纤维细胞和内皮细胞，是皮肤中恶性亚克隆配体的主要贡献者。通过量化每个共存亚克隆的总相互作用权重，我们发现不同的亚克隆 consistently 表现出与其微环境相互作用的差异潜力，并且皮肤中总相互作用权重高的亚克隆通常不是在血液区室中占主导地位的亚克隆。重要的是，我们发现具有高微环境信号接收潜力的亚克隆也表现出更高频率的MKI67阳性细胞，表明外部信号可能诱导这些亚克隆的增殖。

共存恶性亚克隆对金黄色葡萄球菌及其毒素暴露的反应存在质的不同

如上所示，每位患者体内的共存亚克隆在接收微环境信号的能力上存在差异，并且在细胞因子和TCR–NF-κB信号轴等相关通路上富集差异。这促使我们确定共存亚克隆对金黄色葡萄球菌感染的反应是否会不同，这在CTCL中是一个主要的临床问题，并且已知能诱导恶性T细胞的细胞因子和直接TCR刺激。为了验证这一点，我们在存在或不存在从L-CTCL患者病变皮肤分离的活金黄色葡萄球菌菌株培养上清液的情况下，培养了L-CTCL患者的血细胞。共存亚克隆通过CITE-seq鉴定的差异表面标志物表达来区分，并在培养3天后通过流式细胞术分析其活化情况。与亚克隆对细胞因子和TCR–NF-κB轴反应不一致一致，我们发现暴露于活金黄色葡萄球菌上清液的共存亚克隆在活化方面存在显著差异。用金黄色葡萄球菌特异性溶菌内切酶处理细菌后，活化被完全消除。为了确定金黄色葡萄球菌暴露引起的不同亚克隆活化是否由已知能激活CTCL中恶性T细胞的金黄色葡萄球菌肠毒素介导，我们分析了另一名L-CTCL患者的血细胞在存在或不存在产生SE的金黄色葡萄球菌培养上清液的情况下的额外培养物。只有在含有SE的上清液存在时才能观察到恶性亚克隆的活化，并且当用药物抑制负责介导TCR信号传导的近端Src激酶时，活化被完全消除，证实了SE以TCR依赖的方式诱导恶性T细胞的活化。值得注意的是，在同一患者中，两个主要共存亚克隆中只有一个在存在产生SE的金黄色葡萄球菌时发生细胞体积增大和诱导增殖。我们在另外七名L-CTCL患者中证实SE足以诱导共存亚克隆的选择性活化。为了确定亚克隆对金黄色葡萄球菌反应的差异是由于反应动力学、幅度还是质量的不同，我们在存在或不存在SE的情况下培养了六名L-CTCL患者的血细胞，并在4、24、48、72和144小时后使用scTCR+CITE-seq分析亚克隆反应。我们发现共存亚克隆在反应幅度上存在差异，尽管在六名患者中的两名中也发现了亚克隆反应动力学的差异。为了评估共存亚克隆的反应是否存在质的不同，我们扩展了数据集，纳入了另外10名L-CTCL患者的血液，这些患者在反应峰值时在存在或不存在SE的情况下进行培养。由SE在恶性亚克隆中诱导的差异表达基因进行的通路分析产生了具有不同通路激活的四个亚克隆簇。与亚克隆反应的质量差异一致，我们发现来自同一患者的共存亚克隆通常位于不同的SE反应组中。SE反应组在其TCR和活化诱导的表面标志物的上调以及诱导的增殖方面表现出不同的模式。有趣的是，我们在基线离体状态下识别了属于不同SE反应组的亚克隆的转录特征，其中包括几个与T细胞和/或癌症生物学相关的基因。总之，我们的数据表明，共存的恶性亚克隆对金黄色葡萄球菌及其毒素的反应存在质的不同，这可能在这些患者发生金黄色葡萄球菌感染后为某些亚克隆提供选择性优势并增加其侵袭性。

亚克隆在外因诱导的侵袭性方面的差异与其内在耐药性相关

对于L-CTCL患者，治疗反应通常短暂，治疗耐药性的发展是一个常见问题。我们研究了亚克隆对癌症治疗的敏感性是否与其对外部因素的反应性相关。因此，我们用罗米地辛处理L-CTCL患者的血细胞，这是一种临床批准的用于CTCL的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，并使用流式细胞术测量细胞死亡的诱导。有趣的是，虽然非恶性CD4⁺ T细胞和亚克隆B在很大程度上不受治疗影响，但主要亚克隆A显示出存活率和细胞数量的急剧下降。对罗米地辛的反应差异在36小时后的转录水平上已经很明显，其中亚克隆A与亚克隆B和非恶性CD4⁺ T细胞相比，表现出质的不同且更强的整体转录变化。有趣的是，被罗米地辛有效消除的亚克隆A也是在金黄色葡萄球菌暴露后活化和增殖最强烈的亚克隆。这促使我们调查是否可以根据亚克隆所属的SE反应组发现一致的治疗反应差异。我们用六种用于治疗CTCL或已被证明能杀死CTCL患者恶性细胞的抗癌药物处理了12名L-CTCL患者的血细胞。有趣的是，我们发现来自不同SE反应组的恶性亚克隆对抗癌药物的反应不同，并且显示出最高活化和增殖的SE反应组也倾向于对所有研究的药物最敏感。我们还发现SE反应组在其用于CTCL治疗或正在研究的生物制剂靶点基因的表达上存在差异。亚克隆对罗米地辛反应的差异在多个独立重复和个体患者的多次采样中是一致的。最近的一项研究表明，在L-CTCL患者中，金黄色葡萄球菌的存在可以通过TCR–NF-κB依赖途径诱导对抗癌药物的治疗耐药性。确实，我们发现虽然SE反应组3中的亚克隆在本质上对治疗最敏感，但当SE存在于治疗期间时，这些亚克隆对罗米地辛变得完全耐药。亚克隆活化和诱导耐药的差异不仅限于SE，也可以由其他外部炎症因素如IL-2家族细胞因子和另一种超抗原毒素诱导。与我们之前的结果一致，SE诱导的耐药性在对已知能抑制NF-κB信号的硼替佐米的反应中未观察到。重要的是，所有纳入上述分析的患者均未接触过所研究的六种抗癌药物；因此，我们可以排除获得性耐药的参与。因此，尽管反应性恶性亚克隆在外部因素存在时更具侵袭性，但代价是当刺激物移除时，它们本质上对癌症治疗也更敏感。

讨论

L-CTCL预后不良，原因是快速产生治疗耐药性以及频繁且可能致命的感染，尤其是金黄色葡萄球菌感染。在这项研究中，我们表明L-CTCL患者携带多个不同的亚克隆，这些亚克隆在多个组织区室和各种治疗方案中共存很长时间。我们发现共存亚克隆在其基线代谢和信号转导方面存在差异，包括涉及对外部因素反应的途径，这些因素在金黄色葡萄球菌感染如何助长癌症中起主要作用。使用金黄色葡萄球菌上清液和纯化的肠毒素，我们验证了在几名患者中，共存亚克隆在其活化、转录和增殖反应方面存在显著差异。实际上，根据它们对SE的转录反应，亚克隆可以分为不同的功能类别，这些类别在侵袭性和增殖反应方面表现出明显差异。值得注意的是，我们发现对SE表现出最强增殖反应的亚克隆也对一系列抗癌药物最敏感——其中几种已获临床批准用于治疗CTCL。这表明恶性细胞响应外部因素的能力与其内在治疗敏感性之间可能存在直接联系。因此，尽管癌细胞保留响应环境的能力以增加增殖和侵袭性是有利的，但代价是对治疗更敏感。在临床环境中，这种弱点很可能被金黄色葡萄球菌感染和炎症环境的存在所抵消，这两者都是这些亚克隆中药物耐药性的有效诱导剂。重要的是，诱导的耐药性取决于刺激物的持续存在，并可通过其移除来抵消。因此，我们的结果强调，通过靶向细菌感染和抑制炎症环境，我们可以暴露恶性亚克隆的弱点，否则这些亚克隆将难以治疗。

我们表明，共存恶性亚克隆在其组织趋向性和皮肤内的空间定位方面存在差异。实际上，在患者血液中不常见或缺失的亚克隆可能在特定皮肤区室中高度丰富。通过分析同一患者的多个病变，我们验证了这是由于亚克隆皮肤区室趋向性的内在差异，而非单一采样所致。此外，尽管血液中最丰富的亚克隆通常也可以在病变皮肤中找到，但该亚克隆与其他共存亚克隆相比，往往具有更少的细胞间相互作用能力，这反过来又与其在皮肤中降低的增殖活性相关。总的来说，长时间共存的亚克隆的高丰度支持了分支进化模式。这些亚克隆表现出不同的功能能力并栖息于不同的空间生态位或组织区室，表明亚克隆已经分化并适应了在不同条件和生态位下持续存在，而不是直接相互竞争，有效地将L-CTCL的亚克隆进化定义为趋异进化。先前关注蕈样肉芽肿的研究也表明，分支进化可能是CTCL中导致恶性亚克隆的主要途径。然而，在这些研究中，亚克隆是通过每个亚克隆携带不同的TCR重排序列来识别的，这表明CTCL中的恶性转化是胸腺前起源的。在本研究分析的样本中，来自每位患者的共存恶性亚克隆总是共享一个共同的TCR克隆型，并且我们在这些患者中没有检测到任何具有恶性CNA或恶性基因或蛋白表达谱的次级T细胞克隆。这种差异可能是由于两种疾病实体，蕈样肉芽肿和L-CTCL的生物学差异所致，但也可能部分归因于使用批量WES与单细胞方法的技术差异。

本研究的一个局限性是使用单细胞RNA测序和推断的CNA进行亚克隆识别。这种方法的选择排除了基于小插入缺失以及SNV识别恶性亚克隆的可能性。实际上，这意味着每位患者的估计亚克隆数量是保守的，并且由较小遗传事件定义的次要亚克隆可能比这里报告的要高。然而，通过利用本研究中亚克隆之间的转录差异，我们可以将具有功能性下游后果的基因组驱动事件与否则在转录上静止的乘客事件区分开来，这使用传统的基于DNA的批量检测方法是不可能的。对于一部分患者，我们使用全基因组DNA测序验证了推断的CNA以及恶性亚克隆之间的遗传和基因组差异，并表明亚克隆CNA伴随着丰富的亚克隆插入缺失和SNV的积累，证实了亚克隆已经不可逆地且功能性地分化，并且可以共存很长时间。

我们表明，反应性恶性亚克隆倾向于在皮肤中更丰富，而反应性较差的亚克隆在来自L-CTCL患者的匹配血液样本中更频繁。结合这些亚克隆在体外的治疗敏感性和抗体治疗靶点差异表达，这一发现为不同治疗方案在受CTCL影响的不同区室中实现反应的速度和效率为何存在显著差异提供了解释。例如，虽然体外光分离置换法和维布妥昔单抗能比在血液中观察到的更快地清除皮肤区室，但在用莫格利珠单抗或阿仑单抗治疗患者时观察到相反的情况，后者分别靶向和消除表达CCR4或CD52的细胞。实际上，据报道，莫格利珠单抗和体外光分离置换法的联合治疗优于任一单独治疗。这突显了绘制患者的亚克隆图谱——以及不同亚克隆对其外部环境和抗癌药物的反应——可能是为患者量身定制合理联合治疗的第一步，并在出现继发性治疗耐药时为下一线治疗选择提供新的机会。

总之，我们表明大多数L-CTCL患者携带多个遗传学上不同的恶性T细胞亚克隆，这些亚克隆对外部因素和抗癌药物的反应不同。这些发现表明，亚克隆的趋异进化增强了整个癌细胞群体的适应性、侵袭性和耐药性。我们对特化癌细胞亚克隆高度复杂网络的发现为这种T细胞癌症的侵袭性疾病进程和治疗耐药性提供了新的解释。我们的发现还表明，持久有效的治疗以及最终的治愈将依赖于完整的亚克隆图谱绘制，以指导新的联合治疗，从而协同靶向给定患者中的所有癌细胞亚克隆。