胰腺癌非编码基因组中保守增强子突变的功能特征研究

《Cancer Research Communications》：Phylogenies of end-stage PDAC. ( A ) Schematics of the clonal and subclonal... Open Access

本刊推荐：本研究通过全基因组测序系统分析胰腺癌（PDAC）非编码区域突变特征，首次揭示保守增强子区域存在独特的SBS39突变富集模式，并发现其与KLF5、TP63等胰腺发育关键转录因子表达失调相关。研究证实增强子突变可导致等位基因特异性表达改变（ASE），为理解非编码基因组在肿瘤进化中的作用提供了新视角。

　　

Abstract

研究团队通过全基因组测序（WGS）对两个独特患者队列的编码和非编码基因组（启动子、增强子和非编码非增强子区域）进行系统性分析。研究发现，在所有四个基因组区域中，经过治疗的癌症比未经治疗的癌症具有显著更高的突变负荷。尽管存在治疗诱导的遗传瓶颈，但每个区域的突变相对比例保持不变。与其他非编码区域相比，增强子区域的突变数量/Mb较低，且具有独特的突变特征（SBS39富集）。通过筛选人类和小鼠基因组中预测的同源区域，研究人员在保守增强子区域发现复发性体细胞突变主要与已知胰腺发育和癌症相关的转录因子（如KLF5和TP63）相关。RNA测序数据显示，携带增强子突变的癌症表现出显著差异的转录表达水平（多为表达缺失），表明其具有功能效应。

Introduction

尽管胰腺导管腺癌（PDAC）的遗传学数据丰富，但其完整的遗传特征尚未完全阐明。大规模全外显子测序研究已揭示PDAC的核心通路突变特征，如KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4等高频率驱动基因突变。近年来非编码基因组在癌症中的作用逐渐受到关注，例如长散在核元件1（LINE-1）活性增加与多种肿瘤类型相关。泛癌症全基因组分析联盟在27种肿瘤类型中鉴定出多个新型非编码基因组复发性体细胞突变。在PDAC中，Feigin等发现启动子区域突变对转录调控相关基因的顺式调控区域具有影响。尽管增强子突变可能通过转录因子动力学在转录变化中发挥重要作用，但相关研究仍较少。

Materials and Methods

研究纳入10例PDAC患者的86个肿瘤基因组和10个正常基因组，其中4例为未经治疗患者，6例接受过化疗。通过Illumina平台进行全基因组测序，使用Burrows-Wheeler Aligner进行序列比对，并通过MuTect和HaplotypeCaller检测体细胞单核苷酸变异（SNV）和插入缺失。增强子区域基于H3K27ac染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据定义，利用ENCODE数据库筛选人类-小鼠保守增强子区域。突变特征分析采用Palimpsest工具，系统进化分析使用Treeomics软件。RNA测序数据通过DESeq2进行标准化处理，等位基因特异性表达（ASE）分析采用cis-X计算框架。

Results

Clinicopathologic and genetic features of the patient cohort

患者队列包括8例IV期和2例IIB期PDAC患者。未经治疗患者的中位生存期为0.5-10个月，治疗患者为9-49个月。全基因组测序共鉴定中位15，312个体细胞突变/样本，治疗组突变负荷显著高于未治疗组（31，914 vs. 7，543突变/样本，P<0.0001）。系统进化分析显示核心驱动基因均为主干突变，治疗患者中出现MUC6、B2M等亚克隆驱动基因突变，提示治疗诱导的遗传瓶颈效应。

Mutational characteristics of the PDAC genome

基因组区域突变频率分析显示，增强子区域突变数量最低（中位73个突变），非编码-NOS区域最高（中位11，312个突变）。突变频率/Mb在编码区、启动子、增强子和非编码-NOS区域分别为2.13、4.38、3.19和3.94。治疗组各区域突变频率均显著高于未治疗组（P<0.0001）。进化时序分析表明，大多数突变发生在最近共同祖先形成之前，且各区域突变比例在治疗压力下保持稳定。

Mutational signatures in PDAC

突变特征聚类分析显示增强子区域具有独特特征，显著富集SBS39特征（P=0.0029），而SBS1、SBS8、SBS40和SBS41特征显著减少（P<0.001）。主成分分析（PCA）进一步证实增强子突变特征的独特性。时钟样突变特征SBS1和SBS5在未治疗组中更常见，提示治疗过程中突变过程的改变。

Mutations in conserved enhancer regions in PDAC

基于H3K27ac ChIP-seq数据鉴定62，015个PDAC增强子区域，其中8，966个（14.5%）为人类-小鼠保守区域。保守增强子区域的突变频率显著低于非保守区域。在两个队列中共同鉴定出11个复发突变基因，包括MYC、KLF5、FOXQ1等转录因子，以及EGLN3、HAS2等与缺氧反应和细胞外基质调控相关的基因。

Gene expression in association with mutated enhancers

RNA-seq分析显示，92个基因在增强子突变样本中表达显著改变，多为表达下调。基因本体分析表明下调基因显著富集于DNA模板转录调控通路。 motif分析发现ELF5和Isl1等转录因子结合位点显著富集（P<0.0001），de novo分析鉴定出Smad2、Nanog和Sox18相关 motif区域。等位基因特异性表达分析进一步验证了增强子突变对基因表达的调控作用。

Discussion

本研究首次系统揭示PDAC保守增强子区域的突变特征和功能影响。发现增强子突变具有独特的SBS39特征，且与KLF5、TP63等胰腺 lineage 基因的表达失调相关。尽管增强子区域突变频率较低，但其在基因组进化中的保守性提示潜在功能重要性。研究局限性包括样本量较小和增强子-基因互作距离的限制，未来需要长读长测序等技术进一步验证增强子突变的功能机制。这些发现为理解非编码基因组在PDAC发病机制中的作用提供了新视角。