多基因型杨树叶高效原生质体分离与转化体系的建立及应用

《Plant Science》：Establishment and application of efficient protoplast isolation and transformation system from leaves of multi-genotype poplars

本研究系统建立了适用于多基因型杨树叶片的原生质体高效分离与转化体系，通过优化酶解方案（ES-I）和纯化方法（W5溶液），显著提升原生质体产量（≥7×10? cells/g）和转化效率（GFP转化率最高达49.55%），为木本植物基因编辑（CRISPR/Cas9）和分子育种提供了关键技术平台。

　　

Highlight

本研究首次建立了跨四类杨树分类组（Leuce、Aigeiros、Tacamahaca和Turanga）的多基因型原生质体高效分离与转化体系，系统性评估了原生质体解离、纯化和转化效率的基因型差异，为杨树基因功能研究和分子育种提供了通用性技术平台。

The effects of different enzyme solutions on protoplast enzymatic dissociation

两种酶解溶液的对比研究表明：酶解溶液I（ES-I，含1.50%纤维素酶R-10 + 0.50%离析酶R-10）在不同基因型杨树中均能获得显著更高活性的原生质体，其效果优于酶解溶液II（ES-II，含1.50%纤维素酶R-10 + 0.50%果胶酶Y-23）。以杨树‘741’为例，使用W5溶液直接洗涤法在保护原生质体活性方面优于蔗糖密度梯度离心法，且该方法在多基因型中表现出更广的适用性。

Discussion

本研究首次建立了适用于多基因型杨树的原生质体解离与纯化系统。优化后的ES-I结合W5溶液洗涤法在不同遗传背景的杨树基因型中均表现出良好的适用性。尽管原生质体产量和活性存在显著的基因型依赖性，但通过统一的酶解和纯化条件，仍可获得满足数量与质量要求的原生质体，为后续基因功能研究、蛋白互作分析、单细胞测序（scRNA-seq）和CRISPR/Cas9介导的基因编辑提供了可靠技术支撑。

Conclusions

本研究成功建立了一套适用于多基因型杨树叶片的原生质体高效解离与纯化系统。ES-I与W5溶液洗涤的组合方案在不同杨树基因型中具有广泛适用性。尽管不同基因型间原生质体产量和活性存在显著差异，但在统一的酶解与纯化条件下仍能获得符合数量和功能要求的原生质体群体，为杨树及其他木本植物的基因功能研究和精准育种奠定了坚实基础。