番茄Rapid Alkalinization Factors (RALFs)的全基因组鉴定与功能解析：SlRALF2/3在免疫中的关键作用

《Plant Stress》：Genome-wide identification and characterization of Rapid alkalinization factors (RALFs) in tomato and function analysis of SlRALF2/3 in immunity

本研究针对番茄中RALF肽家族功能未知的问题，系统鉴定了12个SlRALF基因，通过进化分析和表达谱解析揭示了其在发育与应激响应中的多效性，并证实SlRALF2/3通过诱导ROS和防御基因表达增强对灰霉病的抗性，为番茄抗病育种提供了新靶点。

　　

在植物王国中，细胞间的通讯往往依赖于一类被称为信号肽的小分子蛋白质。其中，快速碱化因子（Rapid Alkalinization Factors, RALFs）作为富含半胱氨酸的肽类家族，被发现能够调控植物的生长、发育以及应激响应。从最初在烟草中发现其能抑制根生长开始，科学家们已在拟南芥、水稻等多种植物中鉴定出数十个RALF成员，并逐步揭示它们通过与CrRLK1L类受体激酶（如FERONIA）互作来行使功能。然而，作为全球重要蔬菜作物的番茄，其RALF家族却尚未被系统研究，这些肽在番茄免疫应答中的具体作用更是一片空白。

为了填补这一知识缺口，来自重庆大学的研究团队在《Plant Stress》上发表了最新成果。他们首先通过生物信息学分析在番茄基因组中鉴定出12个SlRALF基因，并利用系统发育分析将其与5种双子叶植物的RALF共同分为8个亚家族。通过基因结构和保守基序分析，发现大多数SlRALF基因不含内含子，且其编码的蛋白质具有典型的信号肽、RR酶切位点、YI/LSY motif以及四个保守的半胱氨酸残基。表达谱分析显示，8个SlRALF在花中高表达，暗示其在生殖过程中的作用；同时这些基因可被干旱、盐、低温等非生物胁迫以及flg22、几丁质等病原相关分子模式（PAMP）激活，且对ABA、IAA、GA、MeJA等多种激素响应，提示SlRALFs可能整合多种信号通路调控番茄生理过程。

研究团队进一步选取5个受胁迫和激素诱导显著的SlRALF进行功能验证。亚细胞定位表明它们均分泌至细胞外间隙；酵母双杂交实验证明它们能与番茄FER受体胞外域结合；通过AlphaFold2结构预测，发现SlRALFs与AtRALF23类似，其N端螺旋可与SlLLG2蛋白结合，形成类似的受体复合物。尤为重要的是，在本氏烟中瞬时表达SlRALF2和SlRALF3能显著诱导活性氧（ROS）积累和防御基因（LOX、PR1a、PR2、WRKY8）表达，并增强对灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性，明确揭示了SlRALF2和SlRALF3在植物免疫中的正调控作用。

关键技术方法包括：基于Phytozome数据库的BLASTp同源鉴定；Clustal Omega和IQ-TREE进行多序列比对与系统发育分析；SignalP 5.0和MEME用于信号肽与保守基序预测；qRT-PCR分析组织与胁迫表达谱；GFP融合蛋白进行亚细胞定位；酵母双杂交验证蛋白互作；AlphaFold2预测三维结构；本氏烟瞬时表达与病原接种分析免疫表型。

3.1. Identification and phylogenetic analysis of RALFs in tomato

通过同源搜索鉴定出12个番茄SlRALF蛋白，其分子量介于8.27–23.37 kDa，等电点多大于7。进化分析显示六种双子叶植物的RALF可分为8个群，番茄成员分布于其中5个群，且与马铃薯RALF亲缘最近。

3.2. Gene structure and conserved motif analysis of the SlRALF genes

除SlRALF5含一个内含子外，其余基因均为单外显子结构。保守基序分析发现motif 1–3广泛存在；功能基序分析表明多数成员含信号肽、RR位点、YI/LSY motif及四个保守半胱氨酸，但SlRALF9/12缺失信号肽，SlRALF4/11缺乏RCRR motif。

3.3. Expression patterns of SlRALFs in different tissues and fruit development

qRT-PCR显示8个SlRALF在花中高表达；SlRALF5/6在根、茎、叶和绿果中表达量高；SlRALF4/12在叶中优势表达；SlRALF8/9在根中表达最高。果实发育后期表达普遍较低。

3.4. Expression patterns of SlRALFs in response to different stress and hormone treatments

甘露醇、NaCl、低温胁迫显著诱导SlRALF3/7/8；flg22上调SlRALF2/3/7/12；几丁质激活SlRALF2/3/9/12但抑制SlRALF4/5/11。ABA持续诱导SlRALF3；IAA激活多个基因但抑制SlRALF3；GA上调SlRALF2/3/7/9/10/11；MeJA强烈诱导SlRALF6但抑制SlRALF3/10。

3.5. Subcellular localization of SlRALFs

SlRALF1/2/3/6/7与GFP融合蛋白均定位于细胞外间隙，证实其分泌特性。

3.6. SlRALFs interact with SlFER

酵母双杂交证明五者均与SlFER^ECD互作；结构模拟显示其N端与SlLLG2结合模式与AtRALF23类似，表明保守的识别机制。

3.7. Function of SlRALF2 and SlRALF3 in immunity

瞬时表达SlRALF2/3显著提升H₂O₂含量和防御基因表达，并减小灰霉菌侵染斑直径，证实二者正调控免疫应答。

该研究不仅首次系统解析了番茄RALF家族的特征，还通过多维度实验揭示了SlRALFs在发育和应激响应中的广泛作用，特别是明确了SlRALF2/3通过激活ROS和防御基因增强抗病性的新功能。这些发现为理解植物肽激素的信号转导机制提供了新视角，也为番茄抗病育种提供了潜在的分子靶标。未来研究可进一步探索SlRALFs在花粉管导向、受精等生殖过程中的功能，以及其受体复合物的详细激活机制，从而更完整地揭示RALF肽在植物生命活动中的调控网络。