综述：植物精密基因编辑中高效CAS核酸酶的发展新趋势

本综述系统梳理了CRISPR-Cas系统在植物基因编辑领域的最新进展，重点介绍了Cas9、Cas12、Cas13等核酸酶及其工程化变体（如dCas9、nCas9）的特性与功能机制，并深入探讨了碱基编辑（Base Editing）和先导编辑（Prime Editing）等前沿技术在作物农艺性状改良（如抗逆性、产量）中的应用潜力与挑战。

　　

植物精密基因编辑中高效CAS核酸酶的发展新趋势

引言

全球农业生产正面临气候变化引发的环境逆境及生物胁迫的严峻挑战，导致主要粮食作物和经济作物的产量持续下降。培育具有增强的抗逆性和适应性的作物品种已成为农业科学领域的革命性任务。传统育种方法如驯化和选择育种依赖于自然突变和遗传重组，过程耗时费力。随后发展的诱变技术（如电离辐射、化学诱变剂）虽提高了突变率，但难以避免非预期突变。在此背景下，识别调控特定性状的关键基因至关重要。组学技术，特别是基于LC-MS的定量蛋白质组学，已被广泛应用于研究作物抗逆性和抗病性相关基因。在多种基因组编辑技术中，基于CRISPR-Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列及其相关核酸酶9）的方法已成为改良粮食作物和经济作物最有效的编辑工具。该技术利用简单的互补向导RNA（gRNA）精确靶向宿主基因组中的特定DNA序列，并且Cas核酸酶可根据需要进行定制。

基因组编辑技术的进展：CRISPR/Cas技术

CRISPR-Cas系统以其卓越的准确性和效率彻底改变了基因工程领域。该系统源于细菌和古菌的适应性免疫机制，用于防御噬菌体等外来遗传元件的入侵。其作用机制包括三个关键步骤：适应（捕获外源DNA片段并整合为CRISPR阵列中的间隔序列）、表达（产生crRNA）和干扰（crRNA引导Cas核酸酶切割靶标核酸）。与早期的锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）相比，CRISPR-Cas9技术在成本和操作简便性上具有显著优势，并支持多基因靶向（多重编辑）、精确碱基编辑和基因活性调控。然而，该系统也存在非预期突变（脱靶效应）、Cas9相关的细胞毒性、递送效率低、对易出错的非同源末端连接（NHEJ）修复途径依赖性高以及监管障碍等局限性，亟待优化解决。

Cas9核酸酶的结构洞察

Cas9是研究最深入的核酸酶蛋白，属于II型CRISPR-Cas系统。它是一种RNA引导的DNA内切酶，能够识别并切割特定的核酸靶标，引入DNA双链断裂（DSBs）。多种细菌物种，如脑膜炎奈瑟菌（NmCas9）、金黄色葡萄球菌（SaCas9）、化脓性链球菌（SpCas9）和嗜热链球菌（StCas9）均含有Cas9核酸酶。

用于CRISPR系统的多样化Cas核酸酶类型

为提高CRISPR-Cas系统执行精确遗传改变的准确性、效率和可靠性，研究人员已取得显著进展。高效载体系统和单链向导RNA（sgRNA）的设计提升了基因组改变的效率。更重要的是，多种Cas核酸酶直系同源物的可用性极大地增强了CRISPR-Cas系统的保真度和多功能性。除了经典的Cas9，其他核酸酶如Cas12a、Cas12b、CasΦ、Cas13和Cas14也各具特色。例如，Cas12a识别富含T的PAM序列并产生交错切割，Cas13则靶向RNA而非DNA，扩展了编辑范围。

基于需求的Cas核酸酶功能域修饰

传统的CRISPR/Cas系统严重依赖于产生DSBs及其后续修复（主要通过NHEJ途径），但该过程精度低且易产生非预期的插入或缺失。为克服此限制，碱基编辑和先导编辑等创新技术应运而生。这些技术利用经过工程改造的Cas核酸酶变体，如催化活性失活的dCas9（deactivated Cas9）和仅产生单链切口（nick）的nCas9（nickase Cas9），在不引起DSBs的情况下实现精确的核苷酸替换。碱基编辑器将nCas9与脱氨酶融合，可实现C•G到T•A或A•T到G•C的转换。先导编辑则更为灵活，它利用nCas9与逆转录酶融合，通过先导编辑向导RNA（pegRNA）直接将新的遗传信息写入靶位点。这些尖端技术为作物改良（如抗逆性、除草剂抗性、产量稳定性）提供了更精确、更特异的编辑工具。

结论

多功能CRISPR-Cas基因组编辑技术已在很大程度上彻底改变了植物生物技术。尽管该技术为基因组改变实践带来了巨大进步，但仍存在脱靶效应、递送挑战、Cas9相关细胞毒性、对易错NHEJ途径的依赖以及监管障碍等缺点。目前的研究正致力于解决这些挑战，并优化CRISPR/Cas技术，以在植物中产生更精确的编辑并最大限度地减少非预期效应，从而推动作物育种进入精准化新时代。