富含类黄酮的香柠檬汁浸泡处理提升鲜切朝鲜蓟抗氧化活性与采后品质的创新研究

《Postharvest Biology and Technology》：Improvement of antioxidant activity and postharvest quality of fresh-cut artichoke by dipping in flavonoid-rich bergamot juice

本研究针对鲜切朝鲜蓟因加工易腐败变质的问题，创新性地采用富含类黄酮的香柠檬汁提取物（BE）进行浸泡处理。结果表明，BE处理能有效抑制微生物（如Pseudomonas减少1 log CFU g?1）、降低呼吸速率、延缓褐变并提升抗氧化活性，同时保留"绿叶"挥发性物质（如1-己醇、顺式-3-己烯-1-醇等），显著延长了样品在5°C下9天的货架期，为鲜切蔬菜保鲜提供了可持续策略。

　　

朝鲜蓟（Cynara cardunculus var. scolymus）是一种营养丰富的蔬菜，富含多酚、菊粉、纤维和矿物质，但其采后保鲜面临巨大挑战。特别是当朝鲜蓟被加工成鲜切产品时，制备过程中的切割等步骤会物理损伤组织，显著增加污染和降解风险。鲜切朝鲜蓟呼吸速率加快，快速衰老，微生物腐败和酶促褐变等问题会严重影响其感官、营养和健康促进特性。地中海地区是朝鲜蓟的主要产区，意大利更是全球重要生产国，2023年产量约37万吨，占世界产量的五分之一。因此，开发有效的采后技术来保持品质和延长货架期，对于这种易腐产品至关重要。

以往研究尝试了多种方法，包括使用不同包装材料结合气调包装，以及采用抗氧化溶液（如半胱氨酸、乳酸或精油）进行浸泡处理。乙醇也曾被用作鲜切朝鲜蓟的抗褐变剂。然而，这些方法各有局限，有的影响感官，有的效果不持久。香柠檬（Citrus Bergamia Risso）是意大利南部雷焦卡拉布里亚特产柑橘，其果皮提取的精油广为人知，而香柠檬汁则因富含酚类化合物（主要是类黄酮）而被视为强效营养保健品。香柠檬汁中的类黄酮，如新圣草枸橼苷（neoeriocitrin）、柚皮苷（naringin）、新橙皮苷（neohesperidin）以及它们的3-羟基-3-甲基戊二酰基（HMG）结合物——佩里普林（peripolin）、梅利蒂丁（melitidin）和布鲁替里丁（brutieridin），具有显著的抗氧化和抗菌特性。香柠檬精油和汁的抗氧化和抗菌特性已被报道能改善草莓、橙子和葡萄等多种整果的货架期，以及苹果、梨、猕猴桃和菠萝等鲜切水果的品质。得益于其抗氧化和抗炎特性，香柠檬及其副产品已被用于开发功能性饼干、油、果汁和面食。然而，据我们所知，香柠檬提取物从未被试验用于保鲜新鲜蔬菜在贮藏条件下的品质。

基于这些考虑，本研究首次将鲜切朝鲜蓟浸泡在含有香柠檬汁提取物的溶液中，以在冷藏（5°C）9天内保持其微生物和采后品质。在贮藏期间，还评估了主要品质属性、类黄酮组分以及挥发性有机化合物（VOCs）谱的变化。

为开展本研究，作者团队主要应用了几项关键技术方法：首先，从香柠檬汁中通过固相萃取获得富含类黄酮的提取物（BE），并采用液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）对其特征类黄酮（如neoeriocitrin, naringin, neohesperidin, peripolin, melitidin, brutieridin）进行定性和定量分析。其次，将鲜切朝鲜蓟头浸泡于BE（0.05% w/v）、乙醇（1%，v/v）或自来水（对照）中，处理后于5°C贮藏9天，定期取样分析。样本来源于意大利南部福贾当地农场采收的Violetto品种朝鲜蓟头。第三，采用计算机视觉系统进行图像分析，量化颜色参数（L, a, b*）并计算褐变指数（Browning Index, BI），同时进行感官评价（视觉质量和特征气味）。第四，通过顶空-固相微萃取/气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）分析挥发性有机化合物（VOCs）谱。第五，测定微生物数量（总需氧嗜温菌、Pseudomonas、Enterobacteriaceae、酵母和霉菌）、抗氧化活性（以Trolox当量表示）、总酚含量（以没食子酸当量表示）、o-醌、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性。最后，使用双向方差分析（ANOVA）和主成分分析（PCA）进行统计处理，评估处理和贮藏时间的影响。

3.1. 鲜切朝鲜蓟的采后品质

3.1.1. 视觉质量、特征气味和褐变指数的变化

基于感官评价，用BE处理的朝鲜蓟在视觉质量和无异味方面更受品评小组喜爱。这些样品与新鲜样品相似，而乙醇浸泡对感官评价产生负面影响。这些结果与用不同比例香柠檬果渣强化的面食的感官评价一致，后者在无提取物对照样品的一般可接受性方面表现出相似水平。视觉质量的感官评价主要受缺陷发展的影响，如 receptacle（花托）的褐变和凹陷。相比之下，用BE浸泡的鲜切朝鲜蓟显示出较高的视觉质量评分，主要是延缓了receptacle的褐变。乙醇处理即使控制了褐变，也导致了褐色凹陷的发展，对视觉质量的评估产生了负面影响。此外，用乙醇浸泡的朝鲜蓟因产生难闻气味而不受品评小组喜爱。相反，BE样品在保持特征气味方面也像新鲜朝鲜蓟一样评分。基于贮藏9天后的感官评价，BE样品仍然可销售，而对照样品被认为处于可销售极限。乙醇样品在贮藏6天后刚好处于可销售极限，其货架期持续到9天后。感官评价结果通过计算机视觉系统的颜色评价得到证实。贮藏6天后，苞片的颜色不受处理影响。然而，基于receptacle的颜色，BE和乙醇浸泡都能控制褐变发展。BE对褐变的影响可能与抗氧化化合物的释放有关。另一方面，乙醇先前被不同作者用于鲜切菊芋块茎、鲜切茴香和鲜切朝鲜蓟作为抗褐变剂。

3.1.2. 呼吸速率、重量损失、o-醌、PPO和POD的变化

与感官评价一致，乙醇处理导致呼吸速率与新鲜朝鲜蓟相比显著增加（+42.1%）。最低的呼吸速率平均值在BE和对照样品中测得（分别为75.3±2.6和75.0±3.3 μmol CO₂ Kg^?1s^?1）。呼吸速率是鲜切产品质量和货架期的关键指标。通常，降低的呼吸速率与低代谢、良好品质和延长的货架期相关。根据我们的结果，BE可能被提议用于增强鲜切朝鲜蓟的货架期，因为它控制了呼吸速率。关于重量损失，正如预期，由于处理的鲜切朝鲜蓟在相同条件下贮藏（在开放袋内的托盘中没有观察到显著差异。BE浸泡的积极结果体现在o-醌、PPO和POD活性上，这些值低于乙醇和对照样品中的值。具体来说，最高的o-醌值记录在乙醇浸泡的朝鲜蓟中（0.7±0.05 OD437 nm 5 g^?1），其次是BE处理，而对照样品与新鲜产品相比没有显示任何显著差异。这一发现表明，褐变发展的显著延迟（根据感官和颜色数据）可能归因于用BE处理的鲜切朝鲜蓟增强的抗氧化活性。PPO和POD是参与切面褐变过程的关键酶。前者催化酚类羟基化生成暗色化合物（醌类），而后者仅在过氧化氢（H₂O₂）存在下参与多酚氧化成黑色素（一种暗色素）。

3.1.3. 抗氧化活性和总酚含量的变化

BE样品显示出与新鲜样品相比抗氧化活性值显著增加（+12.1%），而在新鲜样品与乙醇和对照朝鲜蓟之间该参数未观察到显著差异。用BE提取物处理的样品的高抗氧化值表明抗氧化化合物被转移到鲜切朝鲜蓟中，如下所述。关于总酚含量，处理间未检测到显著差异。许多研究报道，在可食用涂层中加入天然提取物通过结合涂层作为防止蒸腾、食源性和采后病原体的物理屏障以及添加到涂层基质中的天然提取物的抗氧化和/或抗菌作用，促进了水果货架期的延长。BE处理对褐变延迟的积极影响（上述报道）可能与抗氧化剂的释放有关，这些化合物可以降低氧化酶的活性。酚类化合物具有强抗氧化活性，被认为是潜在的氧化酶抑制剂。酚类化合物的抗氧化活性主要归因于它们的氧化还原特性，使其能够作为还原剂、氢供体和单线态氧猝灭剂。这些结果与Demircan & Velioglu (2024)的发现一致，他们观察到用富含香柠檬汁粉末的壳聚糖基薄膜涂层的鲜切水果沙拉中褐变和颜色变化的减少。具体来说，水果视觉质量的保持归因于香柠檬的抗氧化特性，有效减缓了氧化过程，稳定了脆弱的天然色素。所有这些数据，与感官评价一致，表明BE浸泡可以被认为是一种可持续的采后处理，能够提高鲜切朝鲜蓟的抗氧化活性和货架期。

3.1.4. 微生物品质的变化

对不同处理和保存的朝鲜蓟进行微生物计数显示，所有考虑的微生物群落在贮藏6天后均出现显著增加。达到的值通常在9天时得到确认，除了少数例外情况与香柠檬BE浸泡提取物相比其他处理具有更大有效性。仅对于Pseudomonads，评估了两个因素（处理效果和贮藏时间对微生物计数的影响）之间 statistically significant interactions (F (4, 18) = 3.731–14.235, p < 0.05)。简单主效应分析显示，与对照样品相比，用BE处理的朝鲜蓟上的Pseudomonas计数在贮藏6天和9天时 statistically lower than those related to the other treatments by ca. a 1 log CFU g^?1。6天后，Enterobacteriaceae和Y/M的计数显示相似值（平均分别为6.44和6.81 log CFU g^?1），与处理无关。正如广泛报道，革兰氏阴性菌，主要是Enterobacteriaceae和Pseudomonadaceae，是贮藏期间在最小加工食品中最常见的可生长微生物物种。Pseudomonas spp. 由于它们的果胶溶解和蛋白水解活性（在0–2°C之间仍具有活性），导致最小加工蔬菜的软腐。作为植物病原体，Pseudomonas spp.（例如P. viridiflava）导致块茎腐烂以及外苞片上的枯萎症状、内侧的暗褐色凹陷病变、边缘的红褐色区域和小而畸形的芽。尽管已有报道称香柠檬对Pseudomonas spp.的体外抗菌活性，但在BE处理的样品中仅发现微弱但显著（P < 0.05）的抑制活性与其他样品相比。数据与Rizzo et al. (2019)记录的一致，他们描述了在用含有从野生茴香提取的精油的可食用涂层处理的即食朝鲜蓟中，在4°C贮藏11天期间Pseudomonas负荷减少1 log CFU g^?1。最近，在冷藏环境下新鲜奶酪中研究了香柠檬汁对主要嗜冷假单胞菌的抗菌有效性。尽管迄今为止没有证据表明直接从香柠檬中提取的类黄酮对朝鲜蓟上存在的微生物酶具有抑制活性，但一些甚至存在于香柠檬皮和 pulp 中的类黄酮已被证明通过抑制其生物膜形成来抑制植物病原细菌，如Pectobacterium carotovorum。然而，不同香柠檬类黄酮苷元之间的相互作用可以增强它们对食源性细菌的抗菌功效，包括圣草酚和橙皮素对Escherichia coli和Salmonella enterica的协同作用，以及圣草酚和柚皮素对Salmonella enterica和Pseudomonas putida的协同作用，以细胞膜作为可能的 primary target site。类黄酮环上羟基的存在和位置，以及碳原子2和3之间的双键的存在，连同位置4上的酮基，通常对于增强抗菌活性很重要。疏水取代基可以增加类黄酮与细胞膜的相互作用。具体来说，具有C5、C7、C3′和C4′羟基化以及C6处香叶基化或异戊烯化的类黄酮表现出更高的抗菌效果。然而，类黄酮最重要的方面是它们必须保留其两亲特性以穿透细菌并发挥其有效的抗菌作用。值得注意的是，类黄酮的作用机制和有效性可能因特定类型的类黄酮和目标微生物而异。此外，一些类黄酮可能涉及多种作用机制，有助于其广谱抗菌潜力。柚皮素和橙皮苷破坏细菌膜的稳定性，导致细胞内容物泄漏；它们还抑制细菌外排系统，恢复抗生素敏感性。柚皮素和地奥司明干扰细菌群体感应和生物膜形成，这对慢性感染至关重要。这些化合物已被证明抑制各种细菌物种（包括Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli和Yersinia enterocolitica）的QS，减少毒力因子产生，并破坏生物膜形成。最后，在某些条件下，类黄酮可以充当促氧化剂并增强活性氧（ROS）的产生，导致微生物细胞中的氧化损伤。关于剩余的微生物种群，处理和未处理样品中的计数与其他作者发现的计数一致。BE对酵母和霉菌种群在贮藏期间没有影响与Rizzo et al., (2021)一致，他们提出观察到的无效性可能是由于酵母对EOs和植物提取物的敏感性低于细菌。大多数已发表的研究报告了使用不同浓度的抗坏血酸和柠檬酸以及创新技术（例如活性包装）的应用来改善朝鲜蓟的微生物品质和货架期。尽管柑橘提取物已被应用于改善不同种类的即食和新鲜食品的货架期，但这是第一项报道香柠檬提取物对鲜切朝鲜蓟中腐败细菌影响的研究。

3.2. 鲜切朝鲜蓟样品中类黄酮的富集

使用的提取方案使我们能够获得富含香柠檬汁六种独特类黄酮的提取物。这些化合物因其生物特性（包括抗氧化和抗菌）而被几位作者表征。为了验证BE浸泡的有效性，检查了定性和定量的类黄酮谱。Naringin、neohesperidin、melitidin和brutieridin在所有BE浸泡的样品中被鉴定出来。通常，这些类黄酮的浓度在浸泡样品中随着贮藏时间而降低。更详细地，naringin在刚浸泡（0天）的BE鲜切朝鲜蓟和贮藏6天的样品中表现出相似的值（约3 mg kg^?1），而在贮藏9天时不存在。Neohesperidin仅在浸泡后（0天）以0.5 mg kg^?1的浓度被发现，而melitidin和brutieridin在浸泡后和贮藏期间都被检测到。Melitidin从0天到6天贮藏显示相似的值，在贮藏结束时减半（0.5 mg kg^?1）。另一方面，brutieridin在刚浸泡后以最高浓度存在（约3.5 mg kg^?1），而在贮藏6天和9天后减半。相反，既未测量到neoeriocitrin也未测量到peripolin在所研究的样品中。这一结果与这些化合物的强抗氧化活性一致，与其化学结构中儿茶酚的存在相关，这导致它们在浸泡过程中容易氧化。尽管naringin已被批准在食品添加剂和调味剂列表中并被普遍认为是安全的，但由于在水中的低溶解度（水是大多数食品制造过程中的主要原料），它仍然很少被用作食品防腐剂。naringin的疏水性可以解释从浸泡水溶液转移到朝鲜蓟的该分子量低。除BE精油外，迄今为止，很少有研究显示此处提取的类黄酮作为单一防腐剂应用于延长食品货架期。然而，由于它们的抗菌活性，强烈建议将它们用作化学防腐剂的替代品。得益于其抗氧化和抗炎特性，香柠檬及其副产品已被用于获得功能性食品，考虑到naringin的口服未观察到 adverse effect level (NOAEL)在人类中约为200 mg kg^?1。然而，上述研究中使用的香柠檬汁和相关提取物的量远高于我们研究中 employed 的量。因此，尽管我们的数据是有希望的，但需要进一步的研究来优化方案，包括BE浓度和技术（例如喷雾过程），以获得也具有生物效应的鲜切朝鲜蓟。关于neohesperidin（特别是新橙皮苷二氢查耳酮，NHDC），欧洲食品安全局（EFSA）基于大鼠NOAEL和应用安全系数，确定了20 mg kg^?1体重/天的可接受每日摄入量（ADI）。该ADI被认为是人类每日消费的安全水平。对于neohesperidin本身（非氢化形式），特定的NOAEL数据较难获得。然而，由于NHDC源自neohesperidin，NHDC的安全数据提供了一些背景。与naringin和neohesperidin相比，neoeriocitrin的特定NOAEL数据较难获得。最近，Maiuolo et al., (2023)研究了BE汁和Cynara cardunculus (Cc)提取物（150:150 mg; BE:Cc）的配方在临床前环境和临床研究中对抗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的效果。来自BE和Cc的提取物分别含有表2中报道的化合物以及倍半萜、咖啡酸衍生物和木犀草素。该配方显示两种组分的协同效应，与单独使用BE或Cc提取物获得的结果相比。同样，他汀类药物，BE a)抑制了参与胆固醇生物合成的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，b)减少了apoB脂蛋白和胆固醇酯的形成，以及c)通过减少肠道吸收和增加胆汁酸排泄来增加胆固醇的粪便排泄。关于Cc，降脂机制包括木犀草素与3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的相互作用，以及肝脏中固醇调节元件结合蛋白途径的调节。BE-Cc配方在减少2型糖尿病肝脏脂肪变性的炎症和氧化应激方面也有效。在之前的一项研究中，BE也被添加到饮用水中并给予NAFLD诱导的大鼠，以确保在10周期间平均50 mg/kg/大鼠/天的剂量。使用高分辨率质谱分析，还对所有朝鲜蓟样品（对照、乙醇和BE）中存在的酚类部分进行了表征。获得的结果能够鉴定所有处理和未处理样品中的主要酚类化合物。该分析显示，朝鲜蓟的整体酚类谱未因 applied 处理而显著改变。这些分子被发现表现出文献中广泛研究的几种生物学功能。关于BE浸泡对煮熟产品的影响，香柠檬类黄酮部分因高温或长时间烹饪而降解。通常，温和烹饪（煮沸最多30分钟），如朝鲜蓟心所需，保留了大部分类黄酮（约80%），并且可能保持一些生物活性。此外，热降解对香柠檬类黄酮的影响可能涉及苷键水解和/或羟基损失，主要取决于pH和基质中氧的存在。相反，柑橘细胞壁多糖（果胶、纤维素）和食品基质减缓了热处理期间的损失。

3.3. 朝鲜蓟样品的挥发性有机化合物

通过非靶向HS-SPME/GC-MS分析研究了新鲜、对照和处理的鲜切朝鲜蓟的VOCs排放。在不同样品（对照、乙醇、BE） across 贮藏时间（0、3、6和9天）共检测到53种挥发性物质。化合物类别包括醛类（14）、酯类（6）、醇类（13）、酮类（3）、萜烯类（13）、酸类（2）和烃类（2）。ANOVA结果显示，萜烯是新鲜样品中的主要化合物（占总VOCs含量的38.1%），其次是醛类（35.4%）和醇类（21.5%）。主要化学成分中，β-selinene (T7)、hexanal (Ald5)、cis-2-hexenal (Ald6)和1-hexanol (Al6)是主要成分（分别占所有VOCs的26.4%、19.6%、14.6%和9.9%）。除了E0（乙醇0天），其中醇类是主要化合物（45.2%），在所有乙醇样品中，醛类是主要挥发物（范围从BE 0天的57.9%到乙醇6天的36.4%），hexanal是最丰富的化合物（范围从BE 0天的36.7%到乙醇6天的19.2%）。随后，为了评估基于不同采后处理（对照、乙醇、BE）的样品聚类，对VOCs数据集进行了PCA分析。将样品得分绘制在PC1与PC2的子空间中（分别占总方差的51.2%和15.9%），观察到新鲜和贮藏样品之间的清晰区分。根据PCA加载值，确定了主要导致得分图中观察到的组分离的VOCs变量。具体来说，选择绝对加载值（LV≥0.8）作为 cut-off 来描述沿PC的最大方差。这强调了19个加载，包括2-methylpropanal (Ald1)、2-methylbutanal (Ald2)、pentanal (Ald4)、hexanal (Ald5)、cis-2-hexenal (Ald6)、2-heptenal (Ald7)、trans-2-nonenal (Ald11)、benzeneacetaldehyde (Ald13)、cis-2-penten-1-ol (Al5)、1-hexanol (Al6)、cis-3-hexen-1-ol (Al7)、3-ethyl-4-methylpentan-1-ol (Al10)、benzyl alcohol (Al12)、phenylethyl alcohol (Al13)、1-penten-3-one (K1)、α-ylangene (T2)和β-himachalene (T6)大多与B样品相关。此外，BE样品似乎具有更高含量的挥发物，并且与所谓的“绿叶”挥发物 statistically correlated。在这些化合物中，1-hexanol、2-hexen-1-ol、cis-3-hexen-1-ol、hexanal、cis-2-hexenal与新鲜度的感官属性（草本气味和草本香气）相关，并直接与积极的香气感官描述符相关联，预计有助于BE样品器官感觉特性的保持。尽管naringin是FDA允许的食品调味物质，但其在食品中的使用仍然有限，因为其刺激性味道和气味通常导致处理样品的适口性低；naringin也被认为是某些柑橘类水果苦味的原因。确实，为了减少类黄酮的负面属性并增加它们在食品中的应用，正在进行创新技术，如 encapsulation。尽管如此，我们的结果首次表明，以 assayed 浓度用BE处理鲜切朝鲜蓟有助于在保存期间保留处理样品的香气。

本研究得出结论，鲜切朝鲜蓟在冷藏下的采后品质通过在含有0.05%（w/v）BE的溶液中浸泡得到改善。鉴于其类黄酮组成（包括neoeriocitrin、naringin、neohesperidin、peripolin、melitidin、brutieridin）赋予的多种生物活性，如抗氧化和抗菌特性，BE浸泡还似乎控制了呼吸速率，减少了Pseudomonas腐败菌的微生物生长（在冷藏下长达6天），并通过延迟褐变过程保持了视觉质量。通过LC-MS测定从BE溶液转移到处理样品的类黄酮量显示，在贮藏第6天，meltidin和naringin含量没有变化，而brutieridin浓度减半。在处理过的朝鲜蓟中，BE浸泡的样品显示出与新鲜产品中发现的相似的VOCs谱。尽管需要进一步的研究来改善BE类黄酮向朝鲜蓟样品的转移并证明它们可能的营养特性，但这些结果可以被视为开发可持续和创新策略以改善鲜切朝鲜蓟在保存期间的采后品质和器官感觉特性的第一步。最后，未来的实验将集中于评估使用气调策略以更好地保存鲜切朝鲜蓟在贮藏期间的品质。该研究为鲜切蔬菜的保鲜提供了一种天然、有效且可能具有营养强化作用的解决方案，具有重要的应用潜力。论文发表在《Postharvest Biology and Technology》期刊上。