《Respiratory Investigation》：Diagnostic utility of standardized assessment of ciliary ultrastructure by transmission electron microscopy in primary ciliary dyskinesia: a Japanese perspective
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本研究针对101例疑似原发性纤毛功能障碍症（PCD）患者，采用国际标准TEM评估方法，发现27例（26.7%）存在类1或类2超微结构异常，其中类1缺陷与DNAH5、CCDC39/40基因突变高度相关。作为遗传检测的补充，TEM在排除性诊断中具有价值，尤其在双杂合突变及situs inversus患者中。然而，DRC1基因纯合突变仅显示轻微异常，凸显TEM作为独立诊断方法的局限性。研究结果为建立标准化TEM诊断体系提供了依据。
宫林明子（Akiko Miyabayashi）| 若林敬子（Keiko Wakabayashi）| 山田宏之（Hiroyuki Yamada）| 伊藤正（Masashi Ito）| 森本浩三（Kozo Morimoto）| 樋形美奈子（Minako Hijikata）| 氏重直人（Naoto Keicho）
日本结核病协会东京研究所病理生理学与宿主防御部门，日本东京清濑松山3-1-24，邮编204-8533
摘要
背景
原发性纤毛运动障碍（Primary Ciliary Dyskinesia, PCD）是一种罕见的遗传性疾病，其特征是纤毛结构或功能异常。其诊断通常需要结合多种检测方法，包括使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察纤毛结构。在日本，当TEM曾是诊断PCD的主要方法时，尚缺乏评估TEM结果的标准化标准，因此其与致病基因之间的关联尚不明确。
方法
本研究根据国际指南，采用标准化的TEM方法对101名疑似PCD患者进行了纤毛超微结构的评估，这些指南将纤毛缺陷分为1类和2类。
结果
27名患者（26.7%）的TEM检测结果显示存在1类或2类纤毛缺陷；1类缺陷（n=19）与日本PCD患者的基因型高度相关，最常见的致病基因为DNAH5和CCDC39/40。当基因检测无法得出明确诊断时，TEM作为辅助工具显得尤为有用，尤其是在同一致病基因中检测到两种未知相型的杂合变异的情况下。对于患有内脏逆位（situs inversus）的PCD患者，TEM的诊断信息尤为关键。然而，在日本PCD患者中最常见的纯合DRC1变异病例中，仅观察到轻微的超微结构异常，这凸显了TEM作为独立诊断方法的局限性。本研究还强调了标准化TEM纤毛超微结构评估的必要性和有效性。
结论
本研究结果为在日本建立更完善的基于TEM的诊断系统奠定了重要基础。
引言
原发性纤毛运动障碍（PCD）是一种罕见的遗传性疾病，发病率约为1/7,500至1/15,000，由于纤毛和鞭毛的运动异常，该病会导致慢性呼吸道感染和频繁的不孕症[1,2]。单一检测方法无法可靠地诊断PCD，通常需要结合多种检测手段，包括基因检测、鼻黏膜一氧化氮（nNO）测量、高速视频显微镜（HSVM）评估纤毛波形、透射电子显微镜（TEM）观察以及纤毛蛋白的免疫荧光（IF）分析[1,3]。
尽管欧美在检测方法上的推荐标准存在差异，但TEM超微结构诊断仍被视为与基因检测并重的关键确诊手段[4,5]。在日本，直到21世纪初，TEM一直是主要的诊断方法，而其有效性和局限性至今尚未得到全面研究[6]。
迄今为止，已发现超过50种PCD致病基因[3,7]，但在约20%-30%的具有明确PCD临床表现和检测结果的患者中，仍无法确定致病基因[3,7]。此外，在欧美国家，约30%的确诊PCD病例中TEM检测未发现明显的超微结构异常[8]。由于不同种族群体中PCD致病基因及其致病变异的分布不同，TEM在各国的实际应用效果可能存在显著差异。
根据Inaba和Furuhata等人在1985-2015年的系统回顾（当时诊断主要依赖TEM），发现内动蛋白臂（IDA）缺陷的发病率高于外动蛋白臂（ODA）缺陷[6]。然而，目前认为孤立的IDA缺陷多为继发于呼吸道感染和炎症[9,10]。当时TEM的超微结构诊断尚未标准化，基因型与表型之间的关联也未得到研究，因此这些结果可能受到TEM诊断技术局限性的影响。
我们根据国际共识指南，标准化了PCD的TEM纤毛超微结构评估方法。为减少观察者偏差，两名观察者在两名监督者的指导下独立评估样本，并制定了详细的纤毛超微结构特征清单，每种特征均通过其在切片中的出现比例进行量化评估。同时，我们分析了这些TEM结果与其他研究中的基因检测结果之间的关联，以探讨日本PCD患者的基因型-表型关系。
研究参与者
本研究共纳入101名患者，主要为成人（男性/女性=47/54；招募时平均年龄40.5±19.0岁），所有患者均接受了TEM检测和基因检测。除一名患者外，其余患者的nNO值均被记录在案[11]，本研究未进行HSVM检测。本研究获得了福寿司医院（Fukujuji Hospital）和日本结核病协会（JATA）的伦理批准（批准编号16024，日期2016年12月28日）。
结果
图1展示了正常纤毛和具有1类纤毛结构缺陷的TEM图像。图2为图1中图像的示意图。
讨论
本研究评估了TEM在诊断日本PCD患者中的实用性和局限性。值得注意的是，在基因检测无法明确诊断的情况下，TEM作为辅助工具发挥了重要作用，尤其是在同一基因中存在两种杂合变异导致明显结构缺陷的情况下。然而，致病性DRC1变异往往仅引起轻微的TEM异常，这突显了该方法的部分局限性[19]。
考虑到26.7%的疑似PCD患者……
作者贡献
N.K.和K.M.设计了本研究。K.M.和M.I.负责鼻黏膜活检并提供了临床信息。H.Y.进行了透射电子显微镜观察。K.W.和A.M.作为观察者评估TEM图像，K.M.和N.K.作为监督者对结果进行了重新评估。M.H.提供了基因数据并进行了解读。A.M.起草了论文初稿，A.M.和N.K.完成了最终定稿。所有作者均批准了最终版本的手稿。
利益冲突声明
作者们不存在任何利益冲突。
致谢
本研究得到了日本厚生劳动福利科学研究基金“难治性疾病研究”（“Diffuse Lung Diseases研究”）以及日本学术振兴会（JSPS）科研资助（项目编号JP18K08196、JP20K08532、JP22K08297、JP23K07616和JP25K11469）的支持。
我们衷心感谢Michael R. Knowles教授在2016年提供机会让我们观摩北卡罗来纳大学的PCD诊断流程。
