基于发色团的光学路径缩短作为荧光微孔板检测中间接缓解内部滤光效应的策略

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Chromophore-driven optical path reduction as an indirect inner filter effect mitigation strategy in fluorescence microplate assays

微孔板荧光检测中通过添加强吸收色散剂抑制次级内滤效应（sIFE），使发射光程缩短，显著扩展高浓度样本的检测线性范围至79吸光度单位/厘米，无需数学校正，适用于多种微孔板类型及仪器配置。

　　微板读数仪在高通量荧光测量中扮演着至关重要的角色，广泛应用于生物化学、生物物理学、医学、诊断学和环境科学等多个领域。然而，内滤效应（Inner Filter Effect, IFE）常常成为影响其测量精度的关键因素。IFE是指样品中某些物质对激发光或发射光的吸收，导致荧光强度的下降，从而破坏荧光与浓度之间的线性关系，使得定量分析变得困难。在本研究中，我们提出了一种实用的方法，用于在微板实验中缓解次级内滤效应（sIFE），使得即使在高光学密度的样品中，也能获得准确的荧光测量结果。

该方法的核心思想是通过引入一种强吸收的染色体（chromophore），以增强初级内滤效应（pIFE）在高吸收荧光染料溶液中的作用。这样，荧光的产生被限制在靠近样品表面的浅层区域，从而有效缓解sIFE的影响，即使在发射光的光学密度高达79吸光单位/厘米的情况下，也能保持测量的准确性。我们通过实验验证了该方法在宽动态范围内能够提供线性荧光-浓度响应（R2 > 0.99），表明在极高浓度的分析物条件下，信号的保真度损失仍然非常有限。此外，这种方法不需要在测量后进行复杂的数学校正，只需将样品与固定量的吸收剂混合，即可直接进行测量，适用于透明或非透明的微板。

与传统的校正方法相比，该方法在物理上减少了发射光的光程长度，使其在各种微板类型和仪器配置下都具有良好的适应性和鲁棒性，从而能够提供一致且准确的测量结果，而无需复杂的实验流程或专门的设备。本研究提出了一种新颖的物理解决方案，用于缓解微板荧光实验中的sIFE问题。通过有策略地调整样品的光学几何结构，我们显著扩展了高密度荧光染料测量的动态范围，超越了传统校正公式的局限性。该方法不仅适用于微板读数仪，还可能在常规荧光计的前表面荧光测量中具有广阔的应用前景。

在荧光光谱学领域，荧光光谱技术是一种广泛使用的分析方法，用于通过物质与电磁辐射的相互作用来检测和定量物质。这种方法非侵入性，适用于多种科学领域，包括生物化学、生物物理学、医学、诊断学和环境科学等。它在生物化学应用中尤为重要，如蛋白质动力学研究、药物筛选、细胞信号传导、体内成像、核酸检测和DNA复制研究等。此外，荧光光谱学还能用于研究分子结构、动态和相互作用，从单个分子到大型复合体，广泛应用于纳米技术领域，用于纳米颗粒的表征和生物传感。

荧光光谱技术的一个显著优势是其高灵敏度。随着光电倍增管和雪崩光电二极管等检测器的引入，痕量分析物的检测能力得到了显著提升。现代微板读数仪通过快速、可重复和高通量的分析，极大地推动了该领域的发展，使用极少量的样品即可完成分析。这对于处理昂贵或稀有的生物化学物质尤为重要。然而，内滤效应（IFE）在某些情况下可能显著影响荧光测量的准确性，尤其是在样品中存在强吸收物质的情况下。

IFE可以分为两种类型：初级内滤效应（pIFE）和次级内滤效应（sIFE）。pIFE发生在激发波长处，而sIFE则发生在发射波长处。为了最小化IFE的影响，通常建议在激发或发射波长处的吸光度不超过0.1，更理想的情况是不超过0.05。IFE可能由荧光染料自身的自吸收，或由溶液中其他染色体的吸收引起。自吸收随着荧光染料浓度的增加而增强，而由其他染色体引起的IFE则与荧光染料浓度无关。高浓度的荧光染料和/或染色体可能导致强烈的IFE，从而导致荧光与浓度之间的非线性响应。这种偏差的程度取决于光学密度和光程的变化，而这些变化受到样品照射几何结构的影响。

尽管在实践中广泛使用微板读数仪，但目前文献中仍缺乏有效的IFE校正方法，这突显了进一步研究的必要性。我们最近开发了ZINFE/NINFE校正方法，适用于具有可调光学元件垂直位置（z）的微板读数仪。这两种方法都使用两个不同z位置的荧光测量（F?(z?)和F?(z?))。其中，ZINFE校正使用一个固定的几何参数k，而NINFE校正则通过数值优化来获得指数N。这些方法的详细推导及其在微板测量中的适用性可以在补充信息（SI）的第3.7小节中找到。

在另一篇近期发表的文章中，我们引入了AddAbs方法，即在每个样品中添加一种强吸收的染色体，以增强由IFE引起的荧光衰减。我们已经证明，添加钾重铬酸盐可以有效缓解喹啉硫酸溶液中的强pIFE（以及较弱的sIFE）。AddAbs方法确保了光吸收主要由添加的染色体控制，从而减少了不同荧光染料浓度引起的荧光强度衰减的变异性。

在本研究中，我们展示了添加吸收染色体的方法比之前认为的更为广泛适用。该方法可以间接缓解sIFE，通过显著增强pIFE，适用于多种实验场景。例如，在涉及叶绿素的光合作用研究中，准确的sIFE校正尤为重要，因为不同的分析物浓度可能淬灭不同的光谱区域，从而在光谱解卷积之前导致数据失真。血红蛋白等血液成分以及血浆样品往往表现出sIFE，此外，腐殖质和某些荧光染料也存在这一现象。例如，常见的荧光标记物如罗丹明红或荧光蛋白DsRed2的吸收尾部可能延伸至其发射区域，而CdSe/ZnS量子点等纳米材料在发射波段接近强吸收（小有效斯托克斯位移）时，可能会重新吸收发射的光子，特别是在发射波长最短的量子点中。

硫黄素是一个有趣的例子，因为其二聚体会产生显著的sIFE，而单体则不会。在这样的情况下，传统的基于稀释的缓解方法可能会将平衡完全推向单体，使得其不适合用于平衡常数测定实验。相反，通过添加吸收剂，可以在广泛的分析物浓度范围内实现稳定的测量结果。进一步的例子来自生物相关的系统，强调了sIFE缓解的挑战，尤其是在内源性染色体可能重新吸收发射光的情况下。例如，在富含血红蛋白蛋白的样品中，血红素的近紫外吸收带与色氨酸的荧光发射带有显著重叠，从而创造了通过重新吸收导致信号衰减的条件。类似地，无标记组织分析由于胶原蛋白和弹性蛋白等结构蛋白的吸收和发射光谱重叠，变得更加复杂。同样，牛奶作为一种典型的不透明生物液体，具有高度的衰减能力，并且含有大量具有相近光谱的天然荧光物质（如视黄醇、核黄素），因此也是sIFE相关现象的另一个重要例子。此外，线粒体悬浮液中NADH的自荧光也代表了一个关键案例，其中sIFE使得定量变得困难。

尽管sIFE在许多情况下都较为常见，但在实际应用中往往被忽视或校正不当，这进一步凸显了需要稳健缓解策略的重要性。我们的研究提供了一种在控制的体外条件下缓解sIFE的物理方法，这种方法特别适用于微板读数仪和前表面荧光测量。此外，还需要注意的是，sIFE并不总是由荧光染料本身引起。例如，当荧光油与非荧光的黑色油混合时，后者会吸收前者的发射光，展示了sIFE如何在复杂基质中发生。这一现象在生物样品中尤为常见，因为样品中可能同时存在多种具有不同吸收和发射特性的物质，使得测量结果受到干扰。

综上所述，内滤效应是荧光测量中的一个重要挑战，尤其是在高光学密度的样品中。传统的校正方法如稀释和数学修正虽然在一定程度上有效，但存在局限性，例如无法适用于不透明的微板或在高吸光度下效果不佳。因此，寻找一种物理上有效且适用于多种实验条件的解决方案变得尤为重要。我们提出的添加吸收染色体的方法通过物理手段增强了初级内滤效应，从而有效缓解了次级内滤效应，使得在高浓度分析物条件下也能获得准确的荧光测量结果。这种方法不仅适用于微板读数仪，还可能在常规荧光计的前表面荧光测量中具有广泛应用前景。通过引入强吸收的染色体，我们能够在实验中减少光程长度，从而提高测量的稳定性和准确性，为荧光测量技术的发展提供了新的思路和方法。