噬菌体SSG23抗宋内志贺菌生物膜及BALB/c小鼠模型的治疗潜力研究

《npj Viruses》：Therapeutic potential of Shigella phage SSG23 against Shigella sonnei biofilms and in BALB/c mice

本文报道了一株新型烈性噬菌体SSG23的分离鉴定及其抗多重耐药志贺菌的潜力。该噬菌体属于Straboviridae科，对四种主要志贺菌血清型均具裂解活性，且在宽pH（4–11）和温度范围（-20°C至50°C）内保持稳定。研究证实SSG23可有效降解生物膜，并与抗生素（如头孢曲松）产生协同作用。体外细胞毒性实验显示其对巨噬细胞无毒，体内BALB/c小鼠模型表明口服SSG23能显著降低细菌定植与排菌，改善肠道组织病理损伤，且未诱导耐药性产生。基因组分析显示其不含毒素或耐药基因，安全性良好。本研究为噬菌体疗法抗志贺菌感染提供了有前景的候选株。

　　

引言

志贺菌是引起细菌性痢疾（志贺菌病）的主要病原体，在全球范围内导致沉重的疾病负担，每年约发生1.65亿病例，其中超过100万例死亡，尤其在发展中国家儿童中危害严重。志贺菌属包括福氏志贺菌、痢疾志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌。近年来，多重耐药志贺菌株的出现使得治疗选择受限，迫切需要替代策略。噬菌体疗法因其宿主特异性、安全性及裂解细菌的能力而重新受到关注。历史上，噬菌体曾用于治疗志贺菌病，但早期研究缺乏严格表征。本研究旨在分离并详细表征一株新型烈性志贺菌噬菌体SSG23，评估其治疗潜力。

结果

抗生素耐药谱与生物膜形成

宿主菌宋内志贺菌对氨苄西林、复方新诺明、呋喃唑酮、红霉素、萘啶酸、司帕沙星和环丙沙星表现出较高耐药性，对阿奇霉素和庆大霉素中度敏感，对氯霉素、头孢曲松、多西环素、氧氟沙星和四环素敏感。

噬菌体形态、宿主范围与EOP

从恒河水样中分离到噬菌体SSG23，其噬斑直径约1毫米。透射电镜显示SSG23具有长形头部（约88.6 ± 3.62 nm）和可收缩尾部（约103.15 ± 3.35 nm），属于Straboviridae科。宿主范围分析表明，SSG23能裂解宋内志贺菌、鲍氏志贺菌、福氏志贺菌2a型和痢疾志贺菌1型，但对伤寒沙门菌等其他肠道病原体无活性。对宋内志贺菌和鲍氏志贺菌的EOP值较高。

稳定性评估

SSG23在pH 4-11范围内保持稳定，最适pH为7.0。在-20°C至50°C温度下1小时孵育后活性保持稳定，60°C以上显著失活。

MOI、一步生长曲线与吸附 assay

在最适感染复数MOI=10时，SSG23对宋内志贺菌的抑制效果最佳。一步生长曲线显示，SSG23在不同志贺菌上的潜伏期为20-35分钟，裂解量为105-224 PFU/细胞。吸附 assay 表明其在10分钟内快速吸附。

噬菌体-宿主相互作用的电镜观察

透射电镜揭示了SSG23感染宋内志贺菌的动态过程：15分钟开始吸附，35-60分钟可见细胞内噬菌体增殖，75分钟细胞完全裂解。

SSG23基因组特征

SSG23基因组为168,820 bp的双链DNA，GC含量40.77%。BLASTn分析显示与T4样Krischvirus噬菌体Ec_Makalu_001、Sf20、Jk32和Brandy高度同源（93.87%-97.56%）。预测到283个ORF，其中111个（39.22%）编码功能蛋白，包括DNA代谢与复制、宿主细胞裂解、基因组包装和结构蛋白模块。未发现毒素、耐药基因或溶原性相关基因，表明其安全性。裂解系统包含孔蛋白、内溶素和Rz样跨膜蛋白。包装系统包含门户蛋白、小末端酶亚基和大末端酶亚基。形态发生涉及40种结构蛋白，包括主要头部蛋白和尾丝蛋白。

系统发育分析

基于末端酶大亚基和尾丝蛋白构建的系统发育树显示，SSG23与T4样肠道噬菌体聚类，属于T4病毒属的新物种。

生物膜定量分析

微孔板 assay 表明，SSG23单独处理6小时可减少约34%的成熟生物膜，头孢曲松单独处理减少约49%，两者联用可协同减少约56.6%的生物膜。

扫描电镜分析生物膜降解

扫描电镜观察证实，SSG23处理导致生物膜结构破坏，细菌分布分散，细胞形态改变，与抗生素联用效果更显著。

细胞毒性 assay

MTT assay 显示，SSG23在10²–10⁹ PFU/mL浓度下对RAW 264.7巨噬细胞存活率无显著影响，表明其无细胞毒性。

血清中和抗体检测

小鼠模型中，SSG23口服给药后第7天血清中出现中和抗体，第21天和第35天抗体滴度进一步升高。噬菌体中和 assay 和ELISA证实了IgG和IgM抗体的产生。尽管存在免疫应答，SSG23仍在体内持续存在并保持疗效。

口服SSG23显著降低小鼠体内志贺菌增殖

在BALB/c小鼠模型中，预防性（感染前给药）和治疗性（感染后给药）口服SSG23均能显著降低粪便中的志贺菌载量。预防组效果优于治疗组。噬菌体在肠道内有效增殖，与细菌清除相关。

预防性与治疗性噬菌体疗法的组织学比较

苏木精-伊红染色显示，感染组小鼠结肠和小肠组织出现严重炎症细胞浸润、隐窝增生和上皮结构破坏。预防组和治疗组均能减轻组织损伤，其中预防组肠道结构保持最完整。透射电镜进一步证实，预防性SSG23处理能维持微绒毛结构、紧密连接和黏液层完整性，而治疗组显示部分恢复。

讨论

本研究首次报道了一株能裂解四种主要志贺菌血清型的多价噬菌体SSG23。其良好的理化稳定性、高裂解效率、生物膜降解能力以及与抗生素的协同作用，使其成为对抗多重耐药志贺菌感染的有力候选。基因组安全性评估和体外体内安全性实验为其临床应用提供了支持。尽管小鼠体内产生了中和抗体，但SSG23仍在感染早期发挥了有效的治疗作用。预防性给药的优越性提示其在高风险人群中的潜在价值。未来研究可关注剂型优化（如封装）以延长体内存留时间。综上所述，噬菌体SSG23在抗志贺菌感染方面展现出巨大的治疗潜力。