非洲猪瘟病毒MGF360-9L通过Rab1A依赖性自噬通路降解DDX20以拮抗其抗病毒作用

《Virologica Sinica》：African swine fever virus MGF360-9L degrades DDX20 through the Rab1A-dependent autophagy pathway to antagonize its antiviral effect

本研究揭示了非洲猪瘟病毒（ASFV）关键毒力因子MGF360-9L通过招募自噬相关蛋白Rab1A介导宿主抗病毒蛋白DDX20的自噬降解，从而拮抗I型干扰素（IFN-I）信号通路并促进病毒复制的新机制，为ASFV免疫逃逸策略提供了重要理论依据，对开发新型抗病毒策略具有重要意义。

　　

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病，自20世纪20年代在肯尼亚首次爆发以来，已蔓延至全球多个地区，给养猪业造成巨大经济损失。ASFV是一种具有复杂基因结构的包膜双链DNA病毒，其基因组编码众多毒力因子，其中多基因家族（multigene families, MGFs）在病毒致病性和免疫调节中发挥关键作用。尽管研究人员已发现某些MGF成员能够调控宿主免疫应答，但具体分子机制尚不明确，这严重制约了ASF的有效防控。

在此背景下，研究人员聚焦于ASFV的MGF360-9L蛋白——前期研究表明该蛋白缺失会显著减弱病毒对猪的致病性，但其作用机制仍不清楚。为了揭示MGF360-9L如何调控ASFV的致病性，研究团队通过质谱分析技术系统筛选了与MGF360-9L相互作用的宿主蛋白，并发现DEAD-box解旋酶20（DDX20）是一个关键相互作用蛋白。有趣的是，DDX20作为D-E-A-D盒RNA解旋酶家族成员，不仅参与RNA代谢，还在抗病毒天然免疫中扮演重要角色。那么，MGF360-9L与DDX20的相互作用究竟如何影响ASFV的复制？这成为了本研究的核心科学问题。

研究人员通过多种技术方法展开系统性探究，主要包括：利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）和GST pull-down技术验证蛋白相互作用；通过免疫印迹（immunoblot）和定量PCR（qPCR）分析基因和蛋白表达；采用双荧光素酶报告基因实验检测IFN-β启动子活性；使用激光扫描共聚焦显微镜（laser-scanning confocal microscopy, LSCM）观察蛋白共定位；借助RNA干扰（RNA interference）技术敲低特定基因表达；在猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages, PAMs）和多种细胞系（如HEK 293T、PK-15、MA104）中进行病毒感染实验。所有ASFV相关实验均在生物安全三级（BSL-3）实验室完成，病毒毒株包括野生型ASFV（ASFV-WT）和MGF360-9L基因缺失株（ASFV-ΔMGF360-9L）。

研究结果首先证实了MGF360-9L与DDX20之间存在特异性相互作用。通过外源和内源免疫共沉淀实验，研究人员发现MGF360-9L能够与DDX20直接结合，且两者在细胞质中发生共定位。更重要的是，在ASFV感染过程中，内源性DDX20与病毒蛋白MGF360-9L同样存在相互作用，这表明这种相互作用具有生物学相关性。

进一步功能实验表明，DDX20对ASFV复制具有显著抑制作用。过表达DDX20能够剂量依赖性地降低ASFV p72和p30基因的转录和蛋白表达水平，而敲低DDX20则促进病毒复制。机制上，DDX20通过激活I型干扰素（IFN-I）信号通路发挥抗病毒作用：过表达DDX20显著增强IFN-β启动子活性，并促进干扰素刺激基因（ISG56、ISG54）的表达。这些发现表明DDX20是宿主限制ASFV复制的关键因子。

令人惊讶的是，研究人员发现ASFV感染会导致DDX20蛋白水平逐渐降低，而这种降解作用依赖于MGF360-9L的存在。当使用MGF360-9L缺失病毒株感染细胞时，DDX20的降解现象消失。通过使用自噬抑制剂3-MA和氯喹（CQ）处理细胞，研究人员证实MGF360-9L通过自噬途径而非蛋白酶体途径介导DDX20降解。过表达MGF360-9L能够显著增加LC3-II/LC3-I比值并促进LC3斑点的形成，表明自噬过程被激活。

为了阐明MGF360-9L如何启动自噬降解过程，研究人员从质谱数据中筛选出多个可能与MGF360-9L相互作用的自噬相关蛋白，包括HSP70、HSP90、ABCE1和Rab1A。功能筛选发现，Rab1A的过表达能够显著促进ASFV复制，而敲低Rab1A则抑制病毒复制。Rab1A作为自噬过程的关键调控因子，被证明与MGF360-9L和DDX20都存在直接相互作用，三者可形成蛋白复合物。

深入机制研究表明，MGF360-9L通过上调Rab1A表达来促进DDX20的自噬降解。在ASFV感染过程中，MGF360-9L负责诱导Rab1A的表达上调，而Rab1A本身也能剂量依赖性地促进DDX20降解。更重要的是，敲低Rab1A能够显著抑制MGF360-9L介导的DDX20降解。共聚焦显微镜观察发现，MGF360-9L能够促进Rab1A与溶酶体标志蛋白LAMP2A的共定位，表明MGF360-9L通过Rab1A调控自噬体与溶酶体的融合过程。

本研究系统揭示了ASFV毒力因子MGF360-9L通过招募宿主自噬相关蛋白Rab1A，介导抗病毒蛋白DDX20的自噬降解，从而拮抗IFN-I信号通路并促进病毒复制的新机制。这一发现不仅深化了对ASFV免疫逃逸策略的理解，也为开发针对ASF的新型抗病毒策略提供了重要靶点。特别值得注意的是，Rab1A作为多种病毒利用的关键宿主因子，可能成为广谱抗病毒药物开发的潜在靶标。该研究发表于《Virologica Sinica》，由Lu He、Xu-Xu Fan等研究人员共同完成，为ASFV与宿主相互作用网络提供了重要补充，具有重要的理论意义和应用价值。