靶向TLR22a的抗原结构优化增强草鱼呼肠孤病毒II型免疫保护作用

《Water Biology and Security》：APC receptor TLR22a-targeted antigen structure optimization enhances immune protection against grass carp reovirus II

本研究针对草鱼呼肠孤病毒II型(GCRV-II)疫苗抗原呈递效率低的问题，通过靶向抗原呈递细胞(APC)受体TLR22a开展抗原结构优化研究。利用真核表达系统构建GFP融合重组蛋白，发现N-vp4-3能显著上调TLR22a和CR1等受体表达。通过计算机模拟和单氨基酸随机突变技术获得N-vp4-3-V96W突变体，该突变体使TLR22a表达提升616倍，血清IgM滴度提高3.61倍，免疫保护率提升48.78%。该研究为APC受体激活机制提供了新见解，为高效疫苗研发提供了新策略。

　　

在中国水产养殖业中，草鱼作为最重要的淡水经济鱼类，其养殖产量占全国淡水养殖总产量的21.44%。然而随着集约化养殖的发展，草鱼出血病频繁暴发，其中草鱼呼肠孤病毒II型(GCRV-II)造成的死亡率高达80%，给养殖业带来巨大经济损失。虽然针对GCRV-II抗原蛋白的疫苗已显示出应用前景，但其效果受到抗原呈递效率不高的限制。

为了解决这一问题，西北农林科技大学动物科技学院的研究团队在《Water Biology and Security》上发表了一项创新性研究。该研究聚焦于通过抗原呈递细胞(APC)受体，特别是TLR22a，来改善抗原识别和摄取，从而增强免疫应答。研究人员利用GCRV-II的优势免疫表位vp4-3，通过真核表达系统构建了GFP融合的重组蛋白(N-vp4-3和C-vp4-3)。

研究团队采用了一系列先进技术方法开展实验。他们从广州渔场获取健康草鱼样本，使用HEK293T细胞进行真核表达，通过免疫沉淀(Co-IP)和共聚焦显微镜技术验证蛋白相互作用，利用计算机模拟和单氨基酸随机突变技术进行抗原优化，并通过实时定量PCR(qRT-PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)分析基因表达和抗体水平，最后进行GCRV-II病毒攻击实验评估免疫保护效果。

3.1. vp4-3重组蛋白的表达与效率分析

研究人员通过无缝克隆技术成功构建了pEGFP-vp4-3和pCMV-C-vp4-3融合质粒，双酶切鉴定证实了vp4-3基因的正确插入。流式细胞术和细胞荧光分析显示，重组质粒在转染24小时后的蛋白表达效率超过60%，其中N-vp4-3蛋白的表达效率达到68.5%，满足蛋白表达要求。

3.2. vp4-3重组蛋白的鉴定

Western blot分析显示N-vp4-3和C-vp4-3融合蛋白大小约为50kDa，圆二色谱分析显示蛋白结构中含有β-折叠区域。通过AlphaFold2预测的N-vp4-3蛋白结构模型质量可靠，与已知GFP蛋白结构高度相似。

3.3. vp4-3重组蛋白对APC受体激活及免疫相关基因表达的分析

免疫试验发现，N-vp4-3蛋白能显著上调脾脏和肾脏中MHC-II和CD80/86的表达。在七种APC受体中，N-vp4-3主要显著诱导TLR4、TLR22a和CR1的上调，其中TLR22a基因水平随着采样时间逐渐增加。

3.4. vp4-3重组蛋白在体内的表达

通过冷冻切片和Western blot分析，证实了vp4-3重组蛋白在草鱼脾脏中的表达，绿色荧光信号表明重组质粒在脾脏中成功表达。

3.5. TLR22a与N-vp4-3蛋白相互作用的分析

Co-IP实验证实TLR22a能与N-vp4-3结合，细胞共定位观察显示TLR22a与N-vp4-3存在共定位现象，表明两者之间存在直接相互作用。

3.6. 基于TLR22a的vp4-3单氨基酸突变修饰分析

通过SWISS-MODEL获得TLR22a结构模板，与N-vp4-3进行蛋白对接，发现N-vp4-3蛋白上的291Glu和409Arg位点与TLR22a受体相互作用。对vp4-3蛋白结构的116个氨基酸进行30种氨基酸类型的随机突变，生成3480个结果，其中9.22%的突变类型能促进更稳定的对接结构。

3.7. vp4-3突变株的表达与鉴定

成功构建了N-vp4-3-^V96^W和N-vp4-3-^A59^P重组质粒，Western blot和流式细胞术证实突变重组质粒的转染效率超过70%，蛋白表达正常。

3.8. vp4-3突变株对TLR22a的激活

免疫实验表明，N-vp4-3-^V96^W能显著上调脾脏中MHC-II和CD80/86的表达，并显著促进草鱼脾脏和肾脏中TLR22a的表达，最高上调约616倍。而不稳定的N-vp4-3-^A59^P突变体则无法有效诱导这些基因的上调。

3.9. 血清特异性抗体应答

ELISA分析显示，N-vp4-3-^V96^W能诱导强烈的免疫应答，免疫后21天的血清抗体水平是对照组的3.61倍，而N-vp4-3-^A59^P的抗体刺激能力较低。

3.10. vp4-3突变株的保护效果

GCRV-II病毒攻击实验显示，N-vp4-3-^V96^W突变株表现出更强的保护效果，使存活率提高48.78%，这与它诱导的高血清抗体水平相关。

该研究的讨论部分强调了TLR22a在鱼类免疫系统中的重要作用。TLR22a作为硬骨鱼类中重要的TLR，不仅能识别病毒RNA，还能响应细菌感染，表现出广泛的配体识别多样性。研究发现vp4-3能有效激活TLR22a，表明TLR22a在抗原识别中的重要性。此外，补体受体CR1的激活也为疫苗设计提供了新方向。

研究结论表明，基于计算机模拟和蛋白对接方法的预测效果显著，单氨基酸扫描技术能够系统评估每个残基对复合物稳定性的贡献。这种方法不仅识别了维持结合亲和力所必需的残基，还揭示了特定替换能增强TLR结合的潜在"热点"残基。N-vp4-3-^V96^W突变体表现出更强的TLR22a结合亲和力，验证了计算预测的准确性。

这项研究阐明了vp4-3诱导草鱼APC免疫激活的机制，为理性设计GCRV-II疫苗提供了宝贵见解。通过结构指导的抗原设计策略，不仅提高了疫苗的免疫原性，也为开发针对其他病原体的高效疫苗提供了新思路。该研究成果对水产养殖业的可持续发展具有重要意义，为鱼类病毒性疾病的防控提供了新的技术途径。