TET2抑制通过AXIN2甲基化调控EGFR TKI耐药的新机制及其在非小细胞肺癌治疗中的意义

《Scientific Reports》：TET2 repression contributes to EGFR TKI resistance in EGFR-mutant non-small cell lung cancer through regulating AXIN2 methylation

本研究针对EGFR突变非小细胞肺癌患者对第一代EGFR TKI产生耐药性的临床难题，通过靶向测序发现TET2突变在T790M阴性亚组中占比11%。研究人员采用RRBS甲基化测序和功能验证实验，首次揭示TET2缺失通过诱导AXIN2启动子高甲基化导致EGFR TKI耐药的分子机制，并证实去甲基化药物地西他滨可逆转该耐药表型，为克服TET2相关耐药提供了新的治疗策略。

　　

在肺癌精准治疗领域，EGFR（表皮生长因子受体）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的出现为携带敏感突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者带来了革命性的治疗突破。然而，获得性耐药如同悬在头顶的达摩克利斯之剑，成为临床实践中的主要挑战。尽管第三代EGFR TKI奥希替尼可克服常见的T790M耐药突变，但仍有相当比例的患者（特别是T790M阴性者）其耐药机制尚未明确，这严重制约了后续治疗策略的优化。

正是在这一背景下，由应航杰、陈亚梅等研究人员组成团队，在《Scientific Reports》上发表了他们的最新发现。他们的研究始于一个关键的临床观察：通过对83例对第一代EGFR TKI产生耐药的NSCLC患者进行靶向二代测序，他们在T790M阴性亚组中检测到了11%的TET2（十一易位癌基因家族成员2）突变。TET2作为一种重要的表观遗传调控因子，其功能是催化5-甲基胞嘧啶（5-mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），从而维持DNA的去甲基化状态。那么，TET2的功能缺失是否正是驱动EGFR TKI耐药的一个隐藏“推手”呢？为了解开这个谜团，研究人员展开了一系列深入的探索。

为了回答上述问题，研究团队运用了多项关键技术。在细胞模型方面，他们利用CRISPR/Cas9技术构建了TET2、AXIN2、CSK等基因的稳定敲低（KD）和过表达（OE）的PC9和H1650肺癌细胞系。在分子机制层面，他们采用了还原表征亚硫酸氢盐测序（RRBS）进行全基因组甲基化图谱分析，并通过亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）验证特定基因的甲基化状态。功能验证则通过CCK-8法检测细胞增殖、Annexin V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡、蛋白质印迹法（Western blotting）分析关键蛋白表达水平来完成。此外，研究还建立了裸鼠异种移植模型，在活体水平评估地西他滨（DCA）联合吉非替尼的治疗效果。

研究结果

TET2抑制诱导EGFR突变NSCLC细胞对吉非替尼耐药

研究人员首先在EGFR敏感突变细胞系PC9和H1650中成功构建了TET2稳定敲低模型。功能实验表明，TET2敲低显著减弱了吉非替尼诱导的细胞凋亡，并降低了细胞对吉非替尼的敏感性。相反，在TET2敲低细胞中回补TET2表达则能恢复其对药物的反应。在分子水平上，TET2敲低导致磷酸化EGFR（p-EGFR）和磷酸化ERK（p-ERK）水平升高，提示EGFR信号通路抑制不完全，这从信号转导角度证实了TET2缺失可引发耐药。

TET2-KD PC9细胞中DNA甲基化的改变

鉴于TET2在DNA去甲基化中的核心作用，研究人员推测其缺失可能通过改变特定基因的甲基化状态诱导耐药。他们通过RRBS技术比较了PC9 TET2 KD细胞与对照细胞的全局DNA甲基化谱。分析结果显示，TET2敲低导致了大量差异甲基化区域（DMRs）的出现，其中位于基因启动子区域的DMRs涉及695个不同基因。

TET2-KD PC9细胞中通过生物信息学分析鉴定出十个候选高甲基化基因

通过对差异甲基化基因进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，并结合已知的耐药通路，研究人员筛选出43个在PC9 TET2 KD细胞中启动子区域发生高甲基化的耐药相关基因。进一步结合基因功能与文献回顾，他们最终遴选出10个候选基因进行后续验证，包括AXIN2、CSK等。

代表性基因的验证及其在PC9细胞吉非替尼耐药中的作用

RT-PCR验证发现，在这10个候选基因中，AXIN2和CSK在PC9 TET2 KD细胞中的表达量显著低于对照组。随后的功能实验表明，敲低AXIN2（而非CSK）能够模拟TET2敲低的表现，导致PC9细胞对吉非替尼的敏感性下降。更重要的是，在TET2敲低细胞中过表达AXIN2，可以部分逆转其对吉非替尼的耐药性。这些结果强有力地证明，AXIN2是TET2下游介导EGFR TKI耐药的关键效应分子。

地西他滨（DCA）逆转TET2-KD EGFR突变NSCLC细胞的吉非替尼耐药

如果TET2抑制确实是通过AXIN2高甲基化引发耐药，那么使用去甲基化药物应能逆转这一过程。研究人员用DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理PC9 TET2 KD细胞，BSAS分析证实DCA能显著降低AXIN2基因的甲基化水平。功能实验表明，DCA处理恢复了PC9 TET2 KD细胞对吉非替尼的敏感性，表现为细胞增殖抑制增加和凋亡率升高。同时，DCA处理还上调了AXIN2的表达并降低了p-ERK水平。此外，DCA还能提升因TET2敲低而下降的5-hmC水平。

地西他滨在体内增强PC9TET2 KD细胞对吉非替尼的敏感性

为了验证体外发现的临床前意义，研究人员建立了PC9 TET2 KD细胞的裸鼠异种移植模型。体内实验结果显示，与单独使用吉非替尼相比，吉非替尼联合DCA治疗能显著抑制TET2敲低肿瘤的生长，表现为肿瘤体积和重量的明显减少。这表明靶向DNA甲基化确实能够克服由TET2缺失引起的EGFR TKI耐药。

结论与讨论

本研究首次系统地阐明了TET2功能缺失通过表观遗传学机制调控EGFR TKI耐药的新通路。研究人员从临床现象出发，结合高通量测序、表观遗传学分析和多层次的功能验证，最终揭示了一条“TET2缺失 → AXIN2启动子高甲基化 → AXIN2表达下调 → EGFR信号通路持续激活 → EGFR TKI耐药”的清晰分子轴线。

这项研究的结论具有多重重要意义。首先，它发现了一种全新的EGFR TKI耐药机制，拓宽了我们对肺癌耐药复杂性的认知。其次，它首次将TET2这一重要的表观遗传调控因子与EGFR靶向治疗耐药联系起来，为理解肿瘤表观遗传失调在治疗失败中的作用提供了新视角。更重要的是，研究证实了去甲基化药物地西他滨能够逆转由TET2缺失引起的耐药性，这为TET2突变或低表达的NSCLC患者提供了潜在的治疗策略，即联合使用EGFR TKI和表观遗传药物可能克服其耐药问题。

当然，该研究也存在一些局限性，例如主要使用了基因敲低模型而非患者来源的TET2突变细胞系，AXIN2下游的具体信号通路（如与Wnt/β-catenin通路的交叉对话）尚未完全阐明等。这些都为未来的研究指明了方向。

总而言之，Jin, Ying团队的研究成功地揭示了TET2-AXIN2表观遗传轴在EGFR TKI耐药中的关键作用，不仅深化了对耐药机制的理解，更重要的是为临床克服特定类型的耐药难题带来了新的希望，推动了非小细胞肺癌精准治疗向更深的层次发展。