热灭活牛分枝杆菌饵料疫苗接种后出现结核病灶加重的獾局部免疫应答差异分析

《Scientific Reports》：Differences in local immune response of bait Mycobacterium bovis heat-inactivated vaccinated badgers showing exacerbated tuberculous lesions after challenge

本研究针对动物结核病(TB)在獾群体中的传播难题，探讨了热灭活牛分枝杆菌(HIMB)口服疫苗的免疫保护机制。研究人员通过免疫组织化学技术对比分析了标准应答与异常应答獾的肺部及支气管淋巴结 granulomas 中免疫细胞（巨噬细胞、T/B淋巴细胞、血浆细胞）和调控蛋白（TGF-β、IL-10、Fox-P3）的分布特征。结果显示，异常应答个体呈现Th1/Th2免疫失衡，表现为IL-10与Fox-P3高表达、巨噬细胞减少及B淋巴细胞异常聚集，导致结核病灶加重；而标准应答组细菌载量显著降低（肺部99.9%，淋巴结85.5%），证实HIMB疫苗可通过平衡免疫应答实现部分保护。该研究为优化野生动物结核病防控策略提供了关键理论依据。

　　

动物结核病是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的慢性传染病，不仅影响畜牧业经济，还威胁公共卫生安全。在欧洲多个地区，欧洲獾（Meles meles）被确认为牛结核病的重要野生动物宿主，其与家畜间的传播链严重阻碍了结核病根除计划。由于欧盟禁止对牛群进行结核疫苗接种，针对獾等野生动物宿主的免疫策略成为控制疫情的关键突破口。热灭活牛分枝杆菌（HIMB）饵料疫苗因稳定性高、安全性好，被视为比卡介苗（BCG）更适用于野生动物的候选疫苗。然而，疫苗免疫效果的个体差异机制尚不明确，尤其少数接种者出现病灶加重的“异常应答”现象，亟待深入解析。

本研究基于Juste等人前期的实验设计，对15只獾（8只接种HIMB疫苗，7只未接种对照）在气管内攻击M. bovis（10³ CFU/只）后，通过免疫组织化学技术定量分析肺部及支气管淋巴结结核肉芽肿中的免疫细胞（巨噬细胞、T/B淋巴细胞、血浆细胞）和免疫调控蛋白（TGF-β、IL-10、Fox-P3）。结合细菌载量（MGIT培养）、肺部病灶体积（MRI）及系统性免疫指标（ELISPOT CFP-10/ESAT-6、ELISA P22），揭示疫苗应答类型与局部免疫特征的关联。

主要技术方法

1. 1.
   实验动物与设计：从西班牙阿斯图里亚斯野外捕获15只成年獾，随机分为HIMB疫苗组（口服饵料，两次免疫）和对照组，94天后经气管接种M. bovis攻毒。
2. 2.
   免疫组织化学：对肺部和淋巴结石蜡切片进行抗体标记（IBA-1、CD3、CD20、λ轻链、TGF-β、IL-10、Fox-P3），通过光学显微镜与图像分析软件定量阳性信号。
3. 3.
   细菌与病理评估：采用MGIT液体培养计算细菌载量，MRI测量肺部病灶体积，ELISPOT和ELISA检测细胞与体液免疫应答。
4. 4.
   统计分析：主成分分析（PCA）探索免疫参数关联性，广义线性模型比较组间差异。

研究结果

细胞计数

异常应答獾的巨噬细胞数量显著低于标准应答组与对照组（p<0.01），且淋巴结中巨噬细胞普遍低于肺部。T淋巴细胞在异常应答组淋巴结中明显减少，而B淋巴细胞在肺部异常聚集，血浆细胞在淋巴结中显著升高（p<0.01），提示体液免疫过度激活与细胞免疫抑制。

蛋白表达

异常应答组IL-10与Fox-P3表达显著高于其他组（p<0.01），TGF-β在疫苗组中整体升高，但标准应答组表现为肺部高于淋巴结的独特分布。这些蛋白的协同高表达与细菌载量、病灶体积正相关，印证其免疫抑制功能。

细菌载量与因子分析

异常应答组细菌载量显著高于对照组（肺部分别为3.54×10⁸ CFU/mL vs 1.78×10⁶ CFU/mL），而标准应答组肺部细菌减少99.9%。PCA显示因子1（60%变异度）关联IL-10/Fox-P3/TGF-β、细菌载量及病灶体积，与巨噬细胞负相关；因子2关联B/T淋巴细胞与ELISPOT应答，提示训练免疫（TRAIM）主导早期防御，适应性免疫作用次要。

结论与意义

本研究首次揭示HIMB疫苗接种后獾的免疫应答分型机制：标准应答表现为Th1/Th2平衡的细胞免疫主导，有效抑制细菌扩散；异常应答则因IL-10、Fox-P3等调控蛋白过度表达，导致巨噬细胞功能抑制、B淋巴细胞异常活化，最终加剧结核病理进展。这一发现不仅解释了疫苗保护效果的个体差异，也为优化疫苗配方（如调节免疫佐剂）提供了靶点。此外，研究强调肺部与淋巴结作为独立免疫 compartments 的功能差异，提示未来疫苗设计需兼顾局部与系统性免疫平衡。该成果发表于《Scientific Reports》，为野生动物结核病精准防控策略奠定了理论基础，对多宿主传染病控制具有广泛借鉴意义。