RHOBTB2通过稳定KLHL13抑制Hippo-YAP1通路促进急性髓系白血病增殖的新机制

《Scientific Reports》：RHOBTB2 enhances cell proliferation of acute myeloid leukemia by modulating Hippo-YAP1 signaling and dependent of KLHL13

本研究针对急性髓系白血病（AML）治疗困境，揭示RHOBTB2通过抑制KLHL13的蛋白酶体降解，稳定KLHL13蛋白，进而抑制Hippo通路活性，减少YAP磷酸化，激活YAP/TAZ转录共激活因子，促进AML细胞增殖、迁移并抑制凋亡。该发现为AML靶向治疗提供了新策略。

　　

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）作为最具侵袭性的血液系统恶性肿瘤之一，长期以来困扰着临床医生和研究者。尽管化疗方案不断优化，靶向药物陆续涌现，但近半数患者仍面临原发耐药或复发难治的困境，总体生存率不容乐观。传统"7+3"方案（阿糖胞苷联合蒽环类药物）及去甲基化药物的疗效瓶颈，迫使科学界深入探索AML发生发展的新型分子机制，寻找更有效的治疗靶点。

在这一背景下，Rho GTP酶家族的非典型成员RHOBTB2引起了研究者注意。既往研究显示，在实体肿瘤中RHOBTB2主要发挥抑癌基因作用，可通过诱导MSI2蛋白降解促进乳腺癌细胞凋亡。但有趣的是，在AML中却呈现截然不同的表达模式——RHOBTB2显著高表达且与不良预后相关。这种组织特异性的功能差异背后隐藏着怎样的分子机制？是否意味着RHOBTB2在AML中通过独特信号网络发挥促癌作用？这些问题成为解开AML治疗新靶点的关键。

来自哈尔滨医科大学附属第二医院血液科的研究团队在《Scientific Reports》发表了创新性研究成果。他们发现RHOBTB2通过直接结合KLHL13蛋白并抑制其蛋白酶体降解，进而调控Hippo-YAP1信号通路活性，最终促进AML细胞增殖、迁移并抑制凋亡。这一发现不仅揭示了RHOBTB2在AML中的独特作用机制，更为靶向RHOBTB2/KLHL13/Hippo通路治疗AML提供了理论依据。

研究采用的主要技术方法包括：基于TCGA和GTEx数据库的生物信息学分析；人AML细胞系KG-1和MOLM13的基因敲降和过表达模型；CCK-8细胞活性检测、Transwell迁移实验、流式细胞术细胞周期和凋亡分析；STRING数据库蛋白质互作预测与Co-IP验证；Western blot蛋白表达检测；蛋白酶体抑制剂MG-132和蛋白质合成抑制剂CHX处理实验。

RHOBTB2表达在AML患者中显著上调

通过GEPIA2数据库分析173例AML患者和70例对照样本，发现RHOBTB2在AML中表达显著升高（图1A）。生存分析显示高表达RHOBTB2的AML患者总体生存率更低（图1B）。体外实验中，研究人员成功在KG-1和MOLM13细胞中构建了RHOBTB2过表达和敲降模型（图1C,D），为后续功能研究奠定基础。

RHOBTB2增强细胞增殖并抑制凋亡

功能实验表明RHOBTB2敲降抑制细胞活性，而过表达增强细胞活性（图2A,B）。细胞周期分析显示RHOBTB2敲降增加G0/G1期细胞比例，减少S期群体；过表达则产生相反效应（图2C,D）。Western blot检测细胞周期相关蛋白发现RHOBTB2敲降降低Cyclin D1和CDK4表达，上调P53和P21；过表达则增加Cyclin D1和CDK4水平，抑制P53和P21表达（图2E,F）。迁移实验证明RHOBTB2敲降抑制细胞迁移能力，而过表达增强迁移（图2G-H）。凋亡实验证实RHOBTB2敲降促进凋亡，而过表达抑制凋亡（图2I,J）。

RHOBTB2与KLHL13相互作用并抑制KLHL13的蛋白酶体降解

通过STRING数据库预测RHOBTB2相关蛋白（图3A），Co-IP实验证实RHOBTB2与KLHL13在KG-1和MOLM13细胞中存在相互作用（图3B）。免疫荧光染色显示RHOBT2和KLHL13在细胞中共定位（图3C）。RHOBTB2敲降细胞中KLHL13低表达，而过表达细胞中KLHL13升高（图3D,E）。蛋白酶体抑制剂MG-132能够保护KLHL13免受RHOBTB2敲降诱导的降解（图4A），而蛋白质合成抑制剂CHX不影响RHOBTB2过表达后KLHL13的RNA或蛋白表达水平（图4B,C）。这些结果表明RHOBTB2敲降加速了KLHL13降解。

RHOBTB2通过抑制Hippo信号通路调控YAP激活

免疫印迹分析显示，RHOBTB2敲降的KG-1和MOLM13细胞中YAP和下游基因TAZ下调，而YAP磷酸化水平上调（图5A）。相反，RHOBTB2过表达导致YAP和TAZ表达升高，YAP磷酸化状态降低（图5B）。这些结果表明RHOBTB2可能增强Hippo信号传导，从而诱导侵袭性细胞增殖。

RHOBTB2通过招募KLHL13抑制Hippo通路和细胞增殖

KLHL13过表达增加了pYAP的泛素化水平，表明它可能通过增强其泛素介导的降解途径来降低pYAP表达（图6A）。在RHOBTB2敲降细胞中过表达KLHL13，可恢复被抑制的YAP及其下游基因TAZ的活性，同时降低YAP磷酸化水平（图6B）。KLHL13过表达可挽救RHOBTB2敲降导致的细胞活力下降（图6C）。细胞周期分析显示KLHL13过表达挽救了RHOBTB2敲降引起的S期细胞群体减少（图6D）。相应地，它也缓解了P53和P21水平的增加以及Cyclin D1和CDK4表达的减少（图6E）。Transwell实验表明KLHL13过表达减轻了RHOBTB2沉默对KG-1和MOLM13细胞迁移的抑制作用（图6F）。RHOBTB2敲降导致促凋亡蛋白Bax显著上调，但KLHL13过表达部分恢复了Bax水平。相反，抗凋亡蛋白Bcl-2水平呈现相反趋势（图6B）。Annexin V/PI染色实验证明KLHL13过表达部分逆转了RHOBTB2敲降在KG-1细胞中诱导的凋亡增加（图6G）。

研究结论与意义

本研究系统阐述了RHOBTB2在AML中的促癌作用机制：RHOBTB2通过直接结合KLHL13并抑制其蛋白酶体降解，稳定KLHL13蛋白水平；KLHL13通过增强pYAP泛素化降解，抑制Hippo通路活性，减少YAP磷酸化，激活YAP/TAZ转录共激活因子，最终促进AML细胞增殖、迁移并抑制凋亡。

该研究的创新性在于首次发现RHOBTB2在AML中通过KLHL13依赖的方式调控Hippo-YAP1信号通路，揭示了RHOBTB2在血液肿瘤与实体肿瘤中功能差异的分子基础。研究不仅为理解AML发病机制提供了新视角，更重要的是提出了靶向RHOBTB2/KLHL13/Hippo通路治疗AML的新策略，为开发新型靶向药物奠定了理论基础。

然而，研究也存在一定局限性：虽然体外实验证实了RHOBTB2与细胞增殖的相关性，但其临床相关性仍需进一步验证；需要更多实验探索AML中相关分子的调控机制。未来需要通过全面实验验证RHOBTB2在AML中的调控机制，以及开展临床研究来确认这些发现的转化价值。

总之，这项研究证实了RHOBTB2在体外促进细胞增殖和YAP通路激活的作用；明确了RHOBTB2与KLHL13的相互作用，并证明RHOBTB2抑制KLHL13的蛋白酶体降解；最终证实RHOBTB2通过招募KLHL13激活YAP通路，从而促进细胞增殖。这些发现为AML靶向治疗提供了新的潜在靶点和理论依据。