重组乳酸乳球菌递送HPV-16 E6E7融合抗原增强树突状细胞疫苗抗宫颈癌免疫治疗效果的研究

《Future Microbiology》：Recombinant lactococcus lactis expressing HPV-16 E6E7 dual antigens for potential cervical cancer treatment enhances dendritic cell vaccines efficacy

本研究创新性地利用重组乳酸乳球菌（L.L）携带HPV-16 E6E7原核-真核双表达框架，成功构建了可同时激活树突状细胞（DC）并增强抗原交叉呈递的疫苗载体。该疫苗通过促进Th1型免疫反应和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答，显著抑制TC-1肿瘤生长，为宫颈癌免疫治疗提供了新策略。

　　

ABSTRACT

Aims

靶向人乳头瘤病毒（HPV）16型早期蛋白E6和E7的抗肿瘤疫苗是宫颈癌的潜在免疫治疗方法，但其机制尚不明确。乳酸乳球菌（L.L）被公认为安全（GRAS）微生物，具有作为递送载体的潜力。本研究探讨了L.L对树突状细胞（DCs）激活的免疫调节作用，并评估了携带原核-真核HPV-16 E6E7融合抗原的重组L.L疫苗（L.L-De）制备的DC疫苗的抗原递送和抗肿瘤效果。

Methods

研究采用流式细胞术和MTT法分析其佐剂效能，以促进DC激活和T淋巴细胞增殖能力。在C57BL6肿瘤模型中评估了用L.L-De制备的DC疫苗的抗肿瘤效果。

Results

成功构建了在原核-真核表达系统中携带HPV-16 E6E7融合蛋白表达框架的重组L.L，其展现出抗原促进和交叉呈递的佐剂活性。所开发的DC-L.L-De疫苗诱导了抗原特异性Th-1和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，从而抑制了TC-1肿瘤的生长。

Conclusions

本研究证明，携带双表达抗原框架的重组L.L是一种有前景的肿瘤抗原递送载体。

1. Introduction

宫颈癌是一种病因明确的恶性肿瘤。据国际癌症研究机构（IARC）估计，宫颈癌在全球女性常见癌症的发病率和死亡率中均排名第四。由于不同国家和地区的经济差异以及无法根除既有感染等因素，HPV筛查和HPV预防性疫苗在全球范围内仍未普及，这在全球尤其是亚洲造成了经济负担和人口损失。持续的高危人乳头瘤病毒（hr-HPV）感染和免疫抑制因素已知会促进宫颈癌的发展。

治疗性疫苗可诱导肿瘤抗原特异性免疫反应，并恢复和重建免疫系统，为治疗中晚期癌症甚至预防癌症复发提供了前景广阔的临床工具。优化肿瘤抗原的加工和呈递对于诱导抗原特异性免疫反应至关重要。HPV病毒早期基因E6和E7仅在癌前病变和侵袭性病变中表达，通过灭活肿瘤抑制基因产物影响宫颈细胞的恶性转化和肿瘤发生，是HPV诱导恶性肿瘤免疫治疗的理想靶点。为消除野生型HPV-16 E6E7蛋白的致癌风险以及因缺乏单基因抗原表位而导致的免疫逃逸风险，本实验室在替换了HPV-16 E6E7原本可能致瘤的氨基酸位点后，截短了E6E7蛋白，然后分别将E6和E7蛋白串联连接。

抗原加载方法影响抗原呈递细胞（APC）对抗原的加工和递送。携带质粒DNA的重组细菌可递送特定抗原，在刺激宿主免疫系统的同时，降低了异源表达和纯化抗原蛋白的生产成本。乳酸乳球菌（L.L）被美国食品药品监督管理局（US FDA）列为公认安全（GRAS）微生物。作为抗原递送载体，L.L能有效诱导DC中的抗原呈递活性，并刺激效应淋巴细胞产生抗原特异性细胞免疫反应。与大多数倾向于诱导体液免疫而非有效T细胞免疫的疫苗和佐剂不同，L.L作为天然疫苗佐剂，可促进Th-1型细胞因子的表达并增强对肿瘤生长的抑制。此外，L.L通过TLR途径促进DC中的抗原交叉呈递，使其成为诱导强效细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应的理想候选者。

DC将外源性抗原呈递到主要组织相容性复合体I（MHC-I）分子上，对于启动肿瘤特异性CD8⁺ T细胞反应和引发持久的适应性抗肿瘤免疫至关重要。我们先前的结果表明，携带蛋白抗原的L.L可诱导内体渗漏，从而通过ROS途径增加MHC-I抗原复合物肽的交叉呈递。为持续增强MHC-I抗原复合物肽的递送，本研究提议在已有的携带原核蛋白抗原的基础上，建立也携带HPV-16 E6E7嵌合原核真核双表达框架的重组L.L，并探索与DC共培养后建立更有效的针对HPV-16型宫颈癌的治疗性疫苗。

2. Materials and methods

2.1. Cell line strains and mice

TC-1细胞系（表达HPV-16 E6、E7和Ras基因的小鼠HPV16相关癌细胞系）购自中国医学科学院肿瘤细胞库，用于细胞转染的HEK-293T细胞系亦被使用。TC-1细胞系培养于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640完全培养基中。HEK-293T细胞系培养于含10%胎牛血清、1%双抗青霉素-链霉素混合物的advanced DMEM培养基中。所有细胞在37°C、5% CO₂条件下培养。

C57BL6和Balb/c小鼠（雌性，6-8周龄）购自新疆医科大学实验动物中心。动物实验方案经新疆大学实验动物科学伦理委员会批准（XJUAE-2019-027）。

2.2. Plasmids and bacterial strains

质粒pQE30, pMG36e, pcDNA3.0, pUC57-E6E7, pMG36e-CMV-pepN-E6E7-BGH (De), pMG36e-RFP_P-EGFP_D (358), pMG36e-IL-12D (405), pMG36e-CMV-E6E7-BGH (Eu)由新疆生物资源与基因工程重点实验室构建和保存。pMG36e-CMV-pepN-E6E7-BGH包含编码E6E7融合蛋白的真核和原核表达框架。携带pMG36e的重组L.L均在添加10 μg/ml红霉素和0.5%葡萄糖的M17固体培养基中于30°C静置培养48小时。

2.3. Synthesis of E6E7 antigenic epitope chimeras

HPV-16 E6、E7序列来源于本实验室分离的HPV-16病毒基因组（GenBank: FJ006723.1）。通过EPISOPT和IEDB-MHC I网站预测E6和E7蛋白的MHC I抗原表位后，对E6E7基因中的个别氨基酸进行突变、截短，然后分别串联连接，并通过Jcat分析合成在哺乳动物细胞和L.L中高表达的序列。

2.4. Dual expression vectors construction

本实验室先前通过人工合成包含强启动子PpepN的E6E7靶片段，并将其克隆到pQE30载体中获得pQE30-pepN-E6E7-T。该片段随后与经相同酶切回收的pcDNA3.1连接，获得双表达载体pcDNA3.1-pepN-E6E7-T。重组质粒pMG36e-CMV-PepN-E6E7-T-BGHpA通过与经相同酶切回收的pMG36e连接获得。最终，将重组质粒电转化入L.L受体细胞，获得重组L.L-De-E6E7（L.L-De）。以野生型L.L作为阴性对照，并通过Western Blotting检测原核系统中E6E7融合蛋白的表达。

2.5. Transfection of HEK-293T cells

将HEK-293T细胞以1×10⁶ cells/mL铺入六孔板，设置三个复孔。第二天更换为无双抗和血清的Opti-MEM培养基，分别加入pMG36e-CMV-pepN-E6E7-BGH (De)或pMG36e-CMV-E6E7-BGH (Eu)质粒DNA及Lipo8000转染试剂。转染8小时后更换为含血清和双抗的DMEM培养基，于37°C、5% CO₂培养箱中静置培养48小时。收集转染细胞，用Western和IP裂解液冰上裂解，提取总细胞蛋白，通过Western Blotting检测真核系统中E6E7融合蛋白的表达。

2.6. Western Blotting

重组L.L和重组HEK-293T总蛋白在SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶（5%浓缩胶，12%分离胶）上电泳后，电转至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的溶液封闭后，分别与Mouse mAb anti-HPV16 E6/18 E6或Mouse mAb anti-HPV16 E7一抗，以及Goat anti-mouse IgG(H+L)-HRP二抗孵育。最后使用ECL化学发光显色试剂在ChemiDoc?成像系统下检测目标蛋白条带。

2.7. BM-DC treatment, flow cytometry and cytokine detection

从C57BL/6小鼠骨髓细胞中获取GM-CSF衍生的DC（BM-DC），培养6天。使用CD11c⁺ CD86⁺鉴定分化后的BM-DC。

根据先前研究，以1000:1的浓度用三种不同类型的重组L.L和野生型L.L处理DC细胞，共培养2小时后换液，再孵育过夜。收集细胞沉淀，用PBS重悬备用。用不同浓度（10:1/100:1/1000:1）的L.L处理12小时、24小时和48小时后，收集DC检测细胞表面CD40、CD80和MHC I分子的表达；在添加或不添加TLR4抑制剂、TLR2阻断抗体、ERK抑制剂、MAPK抑制剂和JNK抑制剂的情况下预处理后，再次用L.L处理24小时，收集DC检测细胞表面分子表达的差异。按照ELISA试剂盒说明书检测L.L处理24小时后细胞上清液中IL-12p40、IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-α、IFN-β和IFN-γ细胞因子的水平。

2.8. MTT assay

第二次免疫后7天获取脾脏单细胞悬液，调整浓度至3×10⁶ cells/mL，加入96孔板。分别加入纯化的重组E6E7表位肽（特异性抗原组，终浓度10 μg/mL）、BSA（非特异性抗原对照组，终浓度5 μg/mL）和ConA（阴性对照组，终浓度20 μg/mL）刺激孵育72小时。每孔加入5 mg/mL MTT，37°C孵育4小时。吸弃上清，每孔加入100 μL DMSO，震荡后使用酶标仪测定490 nm处的OD值。

刺激指数（SI）=（各刺激孔吸光度值 – 培养基吸光度值）/（未刺激孔吸光度值 – 培养基吸光度值）。

2.9. ELISA assay

第二次免疫后，收集小鼠血清或重组L.L与免疫小鼠DC共培养的上清液，分别按照ELISA试剂盒说明书分析血清和上清液中细胞因子和颗粒酶的水平。

2.10. CTL-killing assay

以TC-1细胞作为靶细胞，在C57BL/6小鼠第二次免疫后7天，处死每组三只小鼠，无菌取出脾脏并研磨，经红细胞裂解液处理后重悬获得脾脏单细胞悬液。使用终浓度为10 μg/mL的E6E7抗原肽刺激体外脾细胞（5.0×10⁴ cells/well），并加入不同数量的效应细胞，使效靶比分别为50:1、25:1和12.5:1。同时设置效应细胞自发释放、靶细胞自发释放和靶细胞最大释放孔。室温孵育5分钟后，用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。

杀伤率（%）=（实验组释放率 – 效应细胞自发释放率 – 靶细胞自发释放率）/（靶细胞最大释放率 – 靶细胞自发释放率）× 100%。

2.11. Immunization of L.L-loaded DC vaccine

将C57BL/6雌性小鼠随机分为7组，每组6只。以LPS和E6E7抗原肽刺激的DC作为阳性对照（LPS-E），PBS作为阴性对照（PBS），单独DC（DC）、加载De的DC（DC-L.L-De）、加载358的DC（DC-L.L-358）作为治疗组。收集TC-1细胞并调整浓度至5×10⁵ cells/mL，以每只100 μL的体积皮下注射到预先消毒的小鼠右后腹侧。一旦肿瘤可触及即开始治疗。每周通过皮内注射进行