转基因作物中新型原卟啉原氧化酶（PPO）蛋白的安全性评估：历史使用、功能等效性与毒理学研究

《GM Crops & Food》：Safety assessment of membrane-associated protoporphyrinogen IX oxidase from Enterobacter cloacae expressed in genetically modified crops

本文系统评估了源自阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）的新型原卟啉原氧化酶（PPO）蛋白在转基因作物中的安全性。研究通过生物信息学分析、理化特性表征（如分子量、免疫反应性、糖基化状态和功能活性）、胃肠消化稳定性（胃蛋白酶和胰酶消化）、热稳定性（25-95°C处理）以及小鼠急性经口毒性试验（NOAEL ≥5000 mg/kg），综合证明了PPO蛋白无过敏原性或毒性风险，且其在大肠杆菌（E. coli）中表达的重组蛋白与植物源PPO具有功能等效性，为PPO在抗除草剂作物中的应用提供了全面的安全证据。

　　

^{引言：PPO蛋白的安全性与应用背景}

原卟啉原氧化酶（Protoporphyrinogen oxidase, PPO）是血红素和叶绿素生物合成途径中的关键酶，广泛存在于细菌、植物和动物中。近年来，源自阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）的PPO基因（H_N90变体）被导入玉米、棉花和大豆等作物中，赋予其对PPO抑制类除草剂的耐受性。尽管PPO在自然界中普遍存在且无已知安全风险，但其作为转基因作物的新表达蛋白，仍需进行系统的安全性评估。本研究采用"证据权重"（weight-of-evidence）策略，从历史安全使用（History of Safe Use, HOSU）、生物信息学分析、蛋白特性表征、消化与热稳定性以及体内毒理学等多维度评估PPO的安全性，为转基因作物的商业化提供科学依据。

^{PPO的历史安全使用与生物信息学分析}

PPO的安全性基础首先源于其来源生物阴沟肠杆菌的广泛存在性。该菌常见于土壤、水体、植物体及动物肠道中，并已在克隆技术、生物降解和生物能源等领域安全应用。此外，PPO所属的HemG蛋白家族在自然界中高度保守，目前已知超过1000个物种含有PPO同源物，其中HemG类PPO变体达2726种，均无致病性或致敏性报道。通过FASTA和滑动窗口肽段检索，对PPO变体序列与过敏原数据库（AD_2025）、毒素数据库（TOX_2025）及专利数据库（PRT_2025）进行比对，结果显示无匹配序列（E值>1×10^-5），且无连续8肽一致或35%以上同源性片段，表明PPO与已知过敏原或毒素无关联。值得注意的是，PPO与益生菌（如乳酸乳球菌Lactococcus lactis和短乳杆菌Lactobacillus brevis）中的同源蛋白序列一致性分别达21%和63.5%，进一步支持其生物安全性。

^{植物源与大肠杆菌源PPO的功能等效性验证}

由于PPO在转基因作物中表达量极低（<1 ppm）且为膜结合蛋白，难以大量提取，本研究使用携带N端6×组氨酸标签（His-tag）的大肠杆菌重组PPO作为植物源PPO的替代物进行安全性研究。通过比对发现，植物源PPO因叶绿体转运肽（Chloroplast Transit Peptide, CTP）不完全加工而含有额外N端氨基酸（如大豆PPO多出3个氨基酸，玉米PPO多出13个氨基酸），但该延伸序列源自植物天然基因（如拟南芥Arabidopsis thaliana的叶绿体白化蛋白），无安全风险。理化性质分析表明，两者表观分子量分别为18.8 kDa（植物源）和19.8 kDa（大肠杆菌源），纯度达97%（大肠杆菌源），且免疫印迹显示一致的免疫反应性。糖基化检测证实两者均无糖修饰，功能活性试验显示比活性分别为266.7 nmol/min/mg（植物源）和258.4 nmol/min/mg（大肠杆菌源），符合预测区间（Prediction Interval, PI），证明其功能等效性。因此，His-tag PPO可作为安全性评估的合适替代物。

^{PPO的胃肠消化稳定性与热稳定性}

蛋白的消化稳定性是评估其潜在致敏性或毒性的关键指标。体外模拟胃肠消化实验显示，PPO在胃蛋白酶（pH 1.2，37°C）作用下，0.5分钟内即被完全降解，5分钟内片段低于检测限；在胰酶（pH 7.5）处理下，5分钟内全长度蛋白完全降解。热稳定性实验表明，PPO在25°C下活性稳定，37°C时活性下降，55°C及以上温度处理15-30分钟后活性完全丧失。这些结果证明PPO在食品加工（如加热）和人体消化过程中易失活降解，降低了其作为完整蛋白暴露的风险。

^{急性经口毒性试验与风险评估}

为满足监管要求，采用GLP规范对CD-1小鼠进行急性经口毒性试验（EPA指南OPPTS 870.1100）。PPO蛋白以5000 mg/kg剂量（两次灌胃，总剂量33.3 mL/kg）给药后，14天内无动物死亡、异常临床观察或体重/摄食量变化。组织病理学检查未见化合物相关病变，确定NOAEL（无观察不良反应水平）≥5000 mg/kg。基于大豆消费量（2.0 g/kg体重/天）和PPO在转基因大豆中的低表达量（0.97 mg/kg干重），计算暴露边际（Margin of Exposure, MOE）为2.6×10⁶，表明人类通过饮食接触PPO的风险可忽略不计。

^{膜蛋白制剂挑战与解决方案}

PPO作为疏水性膜蛋白，需在去污剂Thesit?（0.18%）存在下纯化以维持活性。为降低Thesit?的潜在毒性（小鼠NOAEL为100 mg/kg），研究通过稀释、透析（100 kDa超滤膜）和缓冲液置换（5 mM磷酸钠，28 mM精氨酸，0.1 mM FMN，pH 10.3），将Thesit?浓度从1.2 mg/mg PPO降至0.071%，同时使PPO浓度达76.3 mg/mL。通过核磁共振（NMR）定量验证Thesit?残留量，确保制剂符合动物试验要求。该方法为未来膜蛋白的安全性研究制剂提供了技术参考。

^{结论：PPO的安全性综合论证}

本研究通过历史安全使用、生物信息学、蛋白特性、消化/热稳定性及体内试验的多层次证据，证实PPO无过敏原性、毒性或环境风险。其快速降解特性和热不稳定性进一步支持了安全性结论。此外，N端延伸（最长13个氨基酸）不影响PPO结构功能，且无生物安全顾虑。这一评估框架为转基因作物中新型膜蛋白的安全性评价提供了范例，强化了PPO在农业生物技术中的应用可行性。