重组耻垢分枝杆菌表达Ag85B抗原对结核感染小鼠的免疫治疗作用及机制研究

《Human Vaccines & Immunotherapeutics》：Recombinant Mycobacterium smegmatis expressing antigen 85B for immunotherapy of Mycobacterium tuberculosis-infected mice

本研究构建了表达结核分枝杆菌抗原85B（Ag85B）的重组耻垢分枝杆菌（rMs-Ag85B），证实其作为治疗性疫苗可通过增强体液免疫（特异性IgG及亚类）和细胞免疫（Th1/Th2细胞因子、CD4+/CD8+ T细胞聚集），显著降低感染小鼠脾脏细菌负荷并缓解肺部病理损伤，为结核病（TB）免疫治疗提供了新策略。

　　

rMs-Ag85B构建及其生物学特性

研究通过电穿孔将Ag85B基因导入耻垢分枝杆菌（Ms），成功构建重组菌株rMs-Ag85B。定量PCR（qPCR）和Western blot分析证实，rMs-Ag85B中Ag85B的mRNA和蛋白表达水平均显著高于野生型Ms。在静态培养条件下，rMs-Ag85B在7H9完全培养基和Sauton’s培养基中生长缓慢，对数生长期延长；而在摇床培养条件下，其生长趋势与Ms相似。此外，rMs-Ag85B的生物膜形成能力显著降低，72小时时结晶紫染色显示其生物膜量明显少于Ms。酸fast染色显示两者形态无显著差异，表明Ag85B的过表达可能通过消耗细胞能量或干扰细胞壁脂代谢影响细菌的生理特性。

rMs-Ag85B诱导高水平体液免疫

通过皮下免疫BALB/c小鼠，rMs-Ag85B可诱导显著的Ag85B特异性IgG抗体升高，其水平显著高于Ms免疫组和空白对照组。尽管Ms免疫组也因同源基因（MSMEG_2078和MSMEG_6398）的交叉反应产生一定抗体，但rMs-Ag85B还显著提升了IgG2a等亚类抗体，表明其能驱动更强的Th1型体液免疫应答。

rMs-Ag85B增强细胞免疫应答

体外抗原刺激实验显示，rMs-Ag85B免疫小鼠的脾细胞在Ms菌体蛋白或Ag85B蛋白刺激下，分泌更高水平的Th1型细胞因子（如IFN-γ、IL-2）和Th2型细胞因子（如IL-10）。ELISPOT分析进一步证实，rMs-Ag85B组分泌IFN-γ的细胞频率更高。此外，促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）的分泌以及肺组织中IL-1β和iNOS的转录水平均显著上调，表明该疫苗能有效激活炎症反应和巨噬细胞功能。

rMs-Ag85B降低结核感染小鼠的病理损伤和细菌负荷

在结核分枝杆菌H37Ra感染小鼠模型中，rMs-Ag85B治疗显著减轻了肺部病理损伤：肺泡结构破坏减少、炎症细胞浸润减轻。尽管肺部细菌负荷未见显著下降，但脾脏中细菌数量明显降低，表明疫苗能促进系统性病原清除。免疫组化显示肺组织中CD4⁺和CD8⁺ T细胞聚集增加，流式细胞术证实脾脏中CD4⁺ IFN-γ⁺ T细胞比例显著升高，提示细胞免疫应答增强是细菌清除的关键机制。

rMs-Ag85B提升感染小鼠的体液和细胞免疫

在感染背景下，rMs-Ag85B治疗不仅显著提高了Ag85B特异性和Ms特异性IgG抗体水平，还诱导了更全面的IgG亚类（IgG1、IgG2a、IgG3）应答。细胞因子检测显示，Ag85B刺激后IL-10分泌显著增加，且IFN-γ分泌趋势增强，表明疫苗能平衡Th1/Th2免疫反应，在抗病原的同时调控免疫病理损伤。

讨论

rMs-Ag85B通过Ms载体的天然佐剂性质和Ag85B的免疫优势表位，协同增强抗结核免疫。其减少的生物膜形成可能降低细菌毒力，提高安全性。疫苗诱导的强效体液和细胞免疫应答，特别是CD4⁺ T细胞介导的IFN-γ分泌和脾脏细菌清除，为其作为结核病免疫治疗候选方案提供了依据。未来需扩大样本量并探索其在其他模型中的效果。