胞外细菌重塑肿瘤微环境诱导癌细胞周期停滞和化疗耐药的新机制

《Cancer Cell》：Tumor-infiltrating bacteria disrupt cancer epithelial cell interactions and induce cell-cycle arrest

本研究针对肿瘤浸润细菌如何调控癌症进展的机制难题，通过空间成像、单细胞转录组和功能实验，揭示了胞外Fusobacterium nucleatum（F. nucleatum）通过破坏上皮细胞间连接诱导G0-G1期阻滞和转录静默，进而导致5-FU耐药。该发现为理解微生物-肿瘤互作提供了新视角，并为靶向菌群改善疗效提供了理论依据。

　　

在我们身体的某些角落，一场悄无声息的“微生物战争”正在肿瘤内部上演。长期以来，科学家们发现某些细菌会选择性地富集在肿瘤组织中，特别是口腔和结直肠等黏膜来源的癌症。其中最引人注目的是一种名为具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）的微生物，它的存在往往预示着患者预后较差、更容易发生化疗耐药和肿瘤复发。然而，一个关键问题一直悬而未决：这些细菌究竟是如何影响肿瘤行为的？传统观点认为细菌主要通过侵入癌细胞内部发挥作用，但真实情况可能远比这复杂。

在这项发表于《Cancer Cell》的研究中，Jorge Luis Galeano Nino等研究人员带领我们进入了肿瘤内部的微观世界，揭示了细菌与癌细胞之间一种前所未见的相互作用方式。他们发现，在细菌高负荷的肿瘤区域，细菌主要存在于细胞外空间，像“物理隔板”一样插入癌细胞之间，破坏细胞间连接，导致癌细胞分布变得分散，增殖能力显著下降。更令人惊讶的是，这种物理性的干扰竟然能够诱导癌细胞进入一种类似“休眠”的状态——G₀-G₁期阻滞，从而使它们对常用的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）产生抵抗。一旦药物和细菌被清除，这些“休眠”的癌细胞又能重新恢复活力，继续增殖，这或许解释了为什么某些含有大量具核梭杆菌的肿瘤更容易在治疗后复发。

为了回答这些科学问题，研究团队运用了多种前沿技术方法：首先利用空间成像技术（多重免疫组化结合RNAscope）对人口腔鳞癌和结直肠癌组织进行分析，揭示了细菌的空间分布特征；通过活细胞成像和3D肿瘤球模型，观察细菌与癌细胞的实时相互作用；采用单细胞空间转录组（CosMx-SMI）在单细胞分辨率下解析细菌富集区域的宿主转录组特征；构建小鼠肿瘤模型验证细菌的定植效应；并分析了92例直肠癌患者队列，将实验室发现与临床预后相关联。

细菌富集肿瘤区域中癌细胞的空间分布

研究人员首先通过结合多重免疫组化（IHC）和RNAscope技术，在人口腔鳞癌（OSCC）和结直肠癌（CRC）样本中定位了细菌富集的微环境。他们发现，在这些细菌定植的微龛中，癌细胞分布更加分散，细胞核间距增大，而细菌阴性区域则呈现簇状聚集。更重要的是，细菌阳性区域的癌细胞密度较低，增殖标志物Ki67的表达也显著降低，提示这些细胞的增殖能力受损。

肿瘤内细菌主要定位于细胞外空间

通过机器学习算法对图像进行无监督分析，研究团队量化了细菌在肿瘤组织中的分布情况。他们发现，在高细菌负荷（MOI>80）的区域，细菌主要存在于细胞外空间，并且细菌负荷与细胞外细菌的比例呈正相关。这些高细菌负荷区域具有更少的宿主细胞和更大的平均细胞间距，表明细菌的存在与上皮组织结构的破坏密切相关。

肿瘤内细菌中断癌细胞间的上皮连接

为了探究细菌如何影响上皮细胞间的相互作用，研究人员将表达Lifeact-GFP的HCT-116细胞与临床分离的具核梭杆菌（SB010株）共培养。活细胞成像显示，细菌暴露破坏了上皮细胞间的连接，导致单个细胞脱落，单层扩展受损。而在3D肿瘤球模型中，具核梭杆菌的加入使得肿瘤球变得不规则、球形度降低，细菌定位在细胞连接处，阻止了上皮细胞完全融入肿瘤球结构。电镜观察进一步证实，感染后的肿瘤球细胞连接被破坏，细胞外间隙增宽。

肿瘤内细菌诱导癌细胞G₀-G₁期阻滞

利用荧光泛素化细胞周期指示器（FUCCI）系统，研究人员实时追踪了细菌暴露对癌细胞周期的影响。他们发现，高浓度（MOI=100）的具核梭杆菌暴露可诱导癌细胞停滞在G₀-G₁期，同时G₂-M期细胞比例下降，总细胞数量减少。这种效应并非具核梭杆菌所特有，其他梭杆菌属物种（如F. necrophorum）以及临床分离的非产毒拟杆菌（Bacteroides fragilis）也能诱导类似的G₀-G₁期阻滞。

细胞间上皮连接调控癌细胞周期动力学

研究人员推测，细菌诱导的细胞周期停滞可能与上皮连接破坏有关。为了验证这一假设，他们用胰蛋白酶或DMSO处理3D培养的癌细胞，人为破坏细胞间连接。结果发现，这两种处理都能增加G₀-G₁期细胞比例，类似于细菌感染的效果。当将癌细胞从2D培养（细胞附着于表面）切换到3D培养（细胞间接触为主）时，细菌诱导的G₀-G₁期阻滞效应更加明显，说明细胞间接触在维持细胞周期进程中起着关键作用。

胞外细菌诱导癌细胞G₀-G₁期阻滞

为了区分胞外和胞内细菌的作用，研究人员测试了主要存在于细胞外的Fusobacterium necrophorum。结果显示，尽管F. necrophorum的细胞侵袭能力远低于具核梭杆菌，但它同样能够诱导G₀-G₁期阻滞，减少总细胞数量。这表明细菌诱导的细胞周期停滞主要是由胞外细菌破坏上皮连接所驱动，而不需要细菌侵入细胞内部。此外，短期暴露于具核梭杆菌并未引起明显的DNA损伤（p-γH2AX标记）或特定的基因突变特征，进一步支持了细胞周期停滞是物理性微环境改变的结果，而非遗传毒性效应。

细菌定植微龛中静止的癌细胞

通过CosMx空间单细胞转录组学分析，研究人员在人类CRC肿瘤中解析了细菌富集微环境内的上皮细胞特征。他们发现，位于细菌富集区域（生态位II）的癌细胞总转录本数量和独特基因检测数量均减少，表现出转录静默状态。这些细胞黏附分子（如CDH1）表达下调，抗原呈递相关基因（如HLA分子）表达降低，同时炎症介质（如CXCL8/IL-8）表达上调。与之相邻的生态位IV中的上皮细胞则表现出转化相关基因（如CTNNB1）的上调，提示其可能获得了侵袭性特征。

研究结论与讨论部分强调，这项工作揭示了一种此前未被认识的肿瘤内细菌调控癌症进展的机制：胞外细菌作为肿瘤微环境中的物理实体，通过破坏上皮细胞间连接，诱导癌细胞进入G₀-G₁期阻滞和转录静默状态。这种状态虽然暂时抑制了增殖，却可能帮助癌细胞在恶劣的微环境中存活，并导致其对5-FU等抗代谢化疗药物产生耐药性。对92例直肠癌患者队列的分析发现，肿瘤内具核梭杆菌负荷高的患者对术前新辅助治疗的反应更差，这为实验室发现提供了临床相关性。

该研究的重要意义在于将肿瘤内细菌，特别是胞外细菌，确立为肿瘤微环境的关键调节因子。细菌诱导的癌细胞静息状态可能是导致治疗失败和肿瘤复发的一个重要原因。针对这些微生物因素进行干预，或许能够重新激活这些“休眠”的癌细胞，提高它们对化疗的敏感性，从而为改善癌症治疗效果提供了新的思路。