中国新兴犬呼吸道冠状病毒的遗传进化与致病性特征

《Veterinary Quarterly》：Characteristics of an emerging canine respiratory coronavirus in China

本文系统研究了在中国流行的犬呼吸道冠状病毒（CRCoV）的基因组特征与致病性，成功分离出CRCoV CD1毒株（106 TCID50/mL）并完成5个全基因组测序（PQ725948-PQ725952）。研究发现中国毒株与泰国谱系（OQ621707.1-OQ621727.1）共同存在非编码区连续核苷酸缺失，ORF1ab、HE和S基因的系统发育分析揭示其形成独立进化分支。分子对接显示HE蛋白lectin结构域的S158F/L161F突变可能增强与O-乙酰化唾液酸的结合亲和力（对接能-5.8 kcal/mol）。实验感染证实该毒株可诱发犬只肺炎和气管纤毛脱落，为CRCoV的跨区域传播和变异演化提供了重要证据。

　　

引言

犬呼吸道冠状病毒（CRCoV）作为犬传染性呼吸道疾病（CIRD）的重要病原体，自2003年在英国首次发现以来，已在全球多个国家流行。其基因组约30 kb，编码ORF1ab多聚蛋白、血凝素酯酶（HE）、刺突蛋白（S）等关键蛋白。尽管CRCoV与牛冠状病毒（BCoV）和人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）具有高度遗传相似性（核苷酸相似性96%-98%），但其在中国地区的基因组特征和致病机制研究仍存在空白。本研究通过基因组测序、分子对接和动物实验，首次系统揭示了中国新兴CRCoV毒株的独特遗传进化路径和致病特性。

材料与方法

研究团队于2024年2月至4月从出现呼吸道症状的幼犬（1-3月龄）采集鼻拭子样本，通过二代测序（NGS）和Sanger测序获得5个CRCoV全基因组序列。利用最大似然法构建系统发育树，采用RDP 4.0进行重组分析，并通过RegRNA 3.0预测非编码区调控元件。选择压力分析使用Datamonkey平台的多重算法（FEL/MEME/SLAC/FUBAR），蛋白质结构预测通过SWISS-MODEL和AlphaFold完成。病毒分离使用HCT-8细胞系，并通过间接免疫荧光（IIFA）和透射电镜（TEM）进行鉴定。动物实验以12周龄比格犬为模型，通过qRT-PCR检测组织病毒载量和组织病理学分析。

结果

基因组特征分析显示，5个CRCoV毒株（CD1-CD5）基因组长度在30,852-30,893 nt之间，与泰国2021-2022年毒株（D140NS等）具有最高相似性（99.5%-99.7%）。系统发育分析表明中国毒株与泰国谱系聚集成独立分支，ORF1ab、HE和S基因的进化树与全基因组树高度一致。在非编码区发现两处特异性核苷酸缺失：4.9 kDa与2.7 kDa非结构蛋白基因间区缺失4 nt，2.7 kDa与12.8 kDa区间缺失8 nt，该特征与泰国毒株共享但缺失模式不同。

蛋白突变分析显示，ORF1ab蛋白的K1866R突变导致稳定性降低（ΔΔG=-0.3941）和灵活性增加（ΔΔS_Vib ENCoM=0.221）。HE蛋白出现P62S（酯酶结构域）、S158F和L161F（lectin结构域）突变，其中S158F/L161F可能增强与O-乙酰化唾液酸的结合能力（对接能由-5.5 kcal/mol提升至-5.8 kcal/mol）。S蛋白的4个突变位点（M/T74K、V132L、I/S510T、T972I）均受到正选择压力，其中3个位于S1亚基。

病毒分离与致病性

从临床样本中成功分离出CRCoV CD1毒株，在HCT-8细胞中产生典型细胞病变效应（CPE），病毒滴度达10⁶ TCID₅₀/mL。实验感染显示，攻毒组犬只在4 dpi出现鼻分泌物、打喷嚏和咳嗽症状，9 dpi达到高峰。组织病毒载量检测发现肺部病毒核酸拷贝数最高（10⁷ copies/g），其次为气管和鼻甲组织。组织病理学检查显示肺泡间隔增厚、淋巴细胞浸润，气管上皮细胞纤毛脱落和杯状细胞消失等典型呼吸道病变。

讨论

本研究首次报道了中国CRCoV毒株与泰国谱系共享的非编码区连续缺失模式，提示冠状病毒进化中存在趋同演化现象。HE蛋白lectin结构域突变可能通过增强受体结合能力改变病毒组织嗜性，这与攻毒实验中发现肺部病毒载量显著高于传统靶器官（气管/鼻腔）的结果相互印证。尽管未检测到重组事件，但中国毒株与泰国毒株的紧密聚类暗示可能存在未被识别的传播路径或共同祖先。成功的病毒分离为后续研究CRCoV的宿主适应机制提供了关键工具。

结论

中国地区流行的CRCoV展现出独特的遗传进化特征，包括非编码区缺失、HE蛋白受体结合能力增强以及潜在的组织嗜性改变。持续监测CRCoV的基因组变异和致病性演变，对制定犬呼吸道疾病防控策略具有重要指导意义。