转录质量控制新机制：Integrator与Restrictor的时序性验证调控RNA聚合酶II命运

《Molecular Cell》：Sequential verification of transcription by Integrator and Restrictor

本研究针对真核生物启动子近端RNA聚合酶II（RNAPII）在延伸与提前终止之间的命运决定这一核心问题，揭示了Integrator和Restrictor复合物通过时序性作用机制，分别在RNAPII启动子近端暂停和下游“限制区”设立双重检查点，实现对非编码转录的有效终止。研究人员发现CDK7/9激酶活性拮抗Integrator，而U1 snRNP通过其U1-70K亚基对抗Integrator与Restrictor，共同保障蛋白编码基因的有效延伸。该研究阐明了转录质控的层级调控原理，为理解长基因转录调控和相关疾病机制提供了新范式。

　　

在真核生物细胞核内，RNA聚合酶II（RNAPII）负责转录所有蛋白编码基因和多数非编码RNA。当RNAPII转录起始后，它会在启动子下游约50个核苷酸处进入“启动子近端暂停”状态。这一关键步骤被视为基因表达调控的重要节点，既是质量控制环节，也为后续的延伸或终止决策提供了时间窗口。然而，暂停后的RNAPII究竟如何被引导走向不同的命运——是进行有效的转录延伸，还是提前终止并产生不稳定的非编码RNA——这一直是领域内亟待解决的核心问题。

在人类基因组中，除了蛋白编码基因的有效转录外，RNAPII还会在数以万计的位点进行看似“无效”的转录。例如，在大多数蛋白编码基因启动子上游反向转录产生的启动子上游转录本（PROMPTs），以及从增强子区域双向转录的增强子RNA（eRNAs）。这些转录本通常不稳定，会在合成后很快被核外体降解。这种广泛的转录活动暗示细胞存在严格的质控机制，以及时终止这些“非生产性”的转录事件，防止它们干扰正常的基因表达程序。

此前的研究已发现两个关键复合物参与这一过程：Integrator复合物和Restrictor复合物。Integrator是一个由15个亚基组成的大型复合物，最初因其在小核RNA（snRNA）的3'末端加工中的作用而被发现。近年的研究揭示了它在转录早期阶段的广泛功能，其INTS11内切酶亚基的缺失会导致启动子近端转录的广泛失调。而Restrictor复合物则以ZC3H4为核心蛋白，其缺失同样会导致原本应提前终止的非编码转录（如PROMPTs）被延长和稳定。然而，为什么高等真核生物需要动用两套复合物来控制早期转录？它们之间是协同、冗余还是独立工作？它们的作用机制和时空关系如何？这些问题构成了本研究探索的起点。

为了回答这些科学问题，英国埃克塞特大学Steven West教授团队在《Molecular Cell》上发表了他们的最新研究成果。研究人员巧妙地利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在人类HCT116细胞系中构建了能够快速、条件性降解特定蛋白的细胞模型。他们通过染色质关联RNA测序（caRNA-seq）、哺乳动物天然延伸转录本测序（mNET-seq）、RNA聚合酶II邻近标记蛋白质组学（TurboID）等一系列前沿技术，系统地解析了Integrator和Restrictor在转录质量控制中的功能分工、作用机制及其相互关系。

关键技术方法概述

本研究主要运用了多种功能基因组学技术：通过dTAG降解系统实现INTS4（Integrator组分）和ZC3H4（Restrictor核心蛋白）的快速条件性敲除；利用染色质关联RNA测序（caRNA-seq）分析新生转录本；采用mNET-seq在单核苷酸分辨率下绘制RNAPII的位置图谱；通过RNAPII-TurboID邻近标记技术鉴定与RNAPII在不同转录阶段（如启动子近端暂停、延伸）相关的蛋白质复合物；使用核RNA测序（nucRNA-seq）评估核外体降解底物的分布；并通过POINT-seq分析全转录本以评估共转录剪接效率。此外，还使用了CDK7/9抑制剂（THZ2/DRB）处理以及U1 snRNA反义吗啉寡核苷酸（U1 AMO）干扰等技术手段进行功能验证。

Integrator与Restrictor代表控制非生产性转录的不同通路

研究人员首先构建了可同时降解Integrator组分INTS4和Restrictor核心蛋白ZC3H4的双降解细胞系（dTAG-INTS4/ZC3H4-DHFR）。蛋白质印迹实验证实了该系统的有效性，能够在4小时内快速、特异性地降解目标蛋白。

通过对染色质关联RNA进行深度测序（caRNA-seq），研究人员发现，无论是单独降解INTS4还是ZC3H4，都会导致PROMPTs转录水平的上调及其转录长度的延伸。这表明两个复合物并非完全冗余。进一步的分析显示，Integrator的缺失对PROMPTs的上调效应更显著，且影响的转录本数量更多（74% vs. 22%）。当同时降解INTS4和ZC3H4时，对PROMPTs和eRNAs的上调效应表现出叠加性，提示它们代表了不同的转录衰减通路。值得注意的是，这种叠加效应并非普遍存在于所有非编码RNA，例如snRNA基因的转录仅受INTS4缺失的影响。在蛋白编码基因方向上，虽然也观察到了轻微的上调，但效应向基因3'端逐渐减弱，这可能是由于蛋白编码基因存在支持延伸的机制（如U1 snRNP）。

Integrator和Restrictor在转录的不同阶段被招募到RNAPII

为了探究这两个复合物为何会表现出叠加效应，研究人员利用RNAPII-mTurbo细胞系进行了TurboID邻近标记蛋白质组学分析。该技术通过在RNAPII大亚基的C末端融合mTurbo生物素连接酶，在短期生物素处理后，能够标记并鉴定出与RNAPII邻近的蛋白质。

通过比较不同处理条件下的蛋白质组（例如，用DRB抑制暂停释放后标记，以富集与暂停RNAPII相关的因子；或用起始抑制剂triptolide处理），研究人员发现Integrator组分更倾向于与启动子近端暂停的RNAPII相关联，而Restrictor组分（ZC3H4和WDR82）则在RNAPII暂停释放后与RNAPII的邻近性更强。此外，Integrator的磷酸酶模块（INTS6）和Restrictor潜在的磷酸酶组分（PNUTS）也显示出不同的时间关联性：INTS6在暂停前阶段，而PNUTS在暂停后阶段。对已发表的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据的分析进一步支持了这一结论，显示Integrator和Restrictor在基因上的最大占据峰值位置是不同的，Integrator更早被招募，而Restrictor则占据下游位置。

Restrictor在启动子近端暂停下游施加了一个普遍的限制区

上述蛋白质组学和ChIP-seq数据预测了Restrictor在下游的功能。为了高分辨率地揭示Restrictor如何影响RNAPII的行为，研究人员在ZC3H4-DHFR细胞系中进行了mNET-seq分析。

结果显示，ZC3H4的缺失导致在反义（PROMPT）和正义（蛋白编码）转录方向，RNAPII的占据信号在启动子近端暂停下游的一个特定区域均出现下降。这个区域被命名为“限制区”（restriction zone）。在PROMPT方向上，限制区的信号下降之后伴随着下游信号的升高，表明限制区通常促进反义转录的终止。而在正义方向上，ZC3H4缺失后，限制区之外仅检测到轻微的mNET-seq信号增加，提示大多数RNAPII在蛋白编码基因转录时能够逃逸Restrictor的作用。热图分析证实，这个限制区存在于HCT116细胞中所有蛋白编码基因和反义转录起始位点（TSS）的下游。尽管限制区在正义方向的出现与第一个5'剪接位点大致重合，但它在缺乏内含子的基因和PROMPTs上也存在，表明内含子本身并非建立限制区的决定因素。这些数据揭示了一个由Restrictor依赖的、位于启动子近端暂停下游的普遍转录检查点——限制区。

非生产性转录在限制区内终止

研究人员推测，限制区可能代表了一个决定延伸承诺或转录终止的决策点。为了验证这一点，他们构建了可同时降解核外体核心组分EXOSC3和ZC3H4的细胞系（dTAG-EXOSC3/ZC3H4-DHFR）。

通过核RNA测序（nucRNA-seq）分析发现，EXOSC3的缺失导致PROMPTs转录本的普遍稳定化，而ZC3H4的缺失则导致其延伸。当同时降解ZC3H4和EXOSC3时，核外体敏感性的分布向下游移动，这表明ZC3H4依赖的终止决定了核外体底物的位置。重要的是，即使在ZC3H4缺失后，仍然会产生核外体底物，这表明即使没有Restrictor，下游也存在终止事件。进一步分析显示，每个PROMPT的最大核外体敏感性位点几乎完美地与mNET-seq所定位的限制区重叠。在蛋白编码方向上，核外体也降解一些启动子近端的转录本，但程度低于反义PROMPTs，这通常是因为RNAPII能够频繁逃逸启动子近端终止区以转录全长蛋白编码基因。当同时缺失ZC3H4和EXOSC3时，该区域的核外体敏感性减弱。总之，限制区作为一个决策区域，在此处转录要么终止（PROMPTs/非编码RNA），要么继续进行延伸（蛋白编码基因）。

CDK7/9活性通过Integrator而非Restrictor触发终止

研究人员此前已证明CDK7和CDK9激酶活性可以拮抗Integrator。鉴于Integrator与暂停的RNAPII相关联，而ZC3H4作用于暂停之后，他们预测CDK7/9的抑制不会影响Restrictor。

实验结果表明，在未使用激酶抑制剂的情况下，降解INTS4或ZC3H4对四个内含子基因（PGK1, ENY2, PLEKHF2, NUDCD1）的转录水平影响很小。而CDK7/9抑制则会降低这些转录本的水平。INTS4的缺失能够部分挽救由CDK9抑制导致的转录下降，并完全恢复由CDK7抑制导致的转录下降，这凸显了在这些激酶失活时Integrator的质控功能。相比之下，ZC3H4的缺失无法在CDK7/9抑制下恢复转录，并且同时降解两个因子所得到的结果与单独降解INTS4相似。这些发现支持了ZC3H4（Restrictor）和Integrator控制不同检查点的模型。

U1 snRNA在蛋白编码基因上对抗Restrictor和Integrator

之前的研究表明U1 snRNP通过对抗Restrictor来促进生产性蛋白编码转录。本研究进一步探索了U1是否也对抗Integrator。

研究人员在降解INTS4或ZC3H4的同时，使用反义吗啉寡核苷酸（U1 AMO）抑制U1 snRNA功能，并进行caRNA-seq分析。他们发现，在部分蛋白编码基因上（如PARK7），当U1功能受损时，同时降解INTS4或ZC3H4能够部分恢复因U1抑制而降低的转录信号。根据基因对U1 AMO及复合物降解的反应，研究人员将基因分为四个簇：IZ（同时受Integrator和Restrictor衰减）、I（主要受Integrator衰减）、Z（主要受Restrictor衰减）和N（不受影响）。大约一半的蛋白编码基因在U1 snRNA被抑制时，显示出Integrator/Restrictor依赖的衰减证据。在这些受影响的基因上，当U1被抑制时，降解Integrator或Restrictor所能恢复的转录主要集中在基因的起始部分，表明在这些情况下延伸仍然受损。

U1-70K有助于U1 snRNP促进RNAPII转录延伸

U1 snRNP如何促进转录延伸尚不清楚。基于近期结构研究显示U1-70K直接连接U1 snRNP和RNAPII，研究人员假设U1-70K亚基贡献于U1介导的转录促进功能。

他们构建了可快速降解U1-70K的细胞系（dTAG-U1-70K），并通过POINT-seq分析发现，U1-70K的缺失导致一个显著基因子集（3758个基因）的转录体信号降低，表现出延伸缺陷。尽管U1-70K是U1 snRNP的核心组分，但其缺失对共转录剪接的影响比U1 AMO处理要温和。进一步分析显示，U1-70K敏感基因更可能属于IZ和I簇，其比值比（Odds Ratio）约为4，这将其与Integrator介导的衰减联系起来。更重要的是，在U1-70K缺失的情况下，同时降解INTS11（Integrator的内切酶亚基）或ZC3H4，能够挽救部分基因（METTL27, MFIT2, ZNF691）新生RNA水平的下降。这表明，当U1-70K缺失时，Integrator和Restrictor会衰减部分基因的转录。因此，U1-70K至少部分通过对抗Integrator和Restrictor来促进RNAPII的转录延伸。

研究结论与意义

本研究揭示了RNAPII延伸的多步骤验证机制：一个由Integrator监控的初始阶段和一个涉及Restrictor的后续限制区。

在生产性转录中，CDK7首先在启动子近端暂停前磷酸化RNAPII及相关因子。暂停释放需要CDK9活性，之后RNAPII进入限制区。越过此区通常依赖于U1 snRNP的活性，它通过至少部分依赖U1-70K的方式促进转录延伸。为了监控这一多步骤验证过程，Integrator复合物与启动子近端暂停的RNAPII结合，当CDK7、CDK9或U1 snRNP失活或受损时，它会衰减转录。而在U1 snRNP缺失的情况下，Restrictor复合物会在限制区内终止RNAPII。

这项研究的意义在于：

1. 1.
   阐明了一个核心的转录质控范式：首次清晰地揭示了Integrator和Restrictor这两个关键复合物在时序和空间上的分工协作，建立了转录早期“双重检查点”模型，为理解真核生物如何精确调控基因表达提供了新的理论框架。
2. 2.
   解释了长基因转录的保障机制：阐明了U1 snRNP（特别是U1-70K亚基）通过对抗Integrator和Restrictor的衰减作用，是确保长蛋白编码基因有效延伸的关键因素，深化了对“远程转录”（telescripting）机制的认识。
3. 3.
   揭示了非编码转录的普遍终止机制：发现Restrictor施加的“限制区”是一个普遍存在的转录检查点，这解释了为何ZC3H4广泛存在于所有启动子，但其效应却主要体现在非编码转录上——因为蛋白编码基因拥有更强的抗终止机制（如U1 snRNP）。
4. 4.
   为相关疾病研究提供新视角：Integrator、Restrictor或U1 snRNP功能的失调可能与某些发育性疾病、神经性疾病或癌症相关联，因为其核心功能是维持转录组的正常和稳定。本研究揭示的分子机制为理解这些疾病的病理生理学提供了潜在的新线索。

总之，这项研究通过对Integrator和Restrictor复合物的精细解析，描绘了一幅转录质量控制的前沿图景，揭示了细胞如何通过一套精密的时序性验证系统，来决定RNA聚合酶II的命运，从而确保基因表达的精确性和可靠性。