通过点击化学介导的5'端修饰增强线性mRNA的帽非依赖性翻译及其机制研究

《Nature Communications》：Enhancing cap-independent translation of linear mRNA

研究人员针对帽非依赖性翻译（CIT）mRNA稳定性差、蛋白产量低的问题，开发了CleaN3引物介导的体外转录和点击化学修饰策略，显著提升了mRNA稳定性和翻译效率，并降低免疫原性，为肿瘤和神经退行性疾病治疗提供了新工具。

　　

在mRNA治疗领域，帽依赖性翻译一直是主要研究方向，特别是在COVID-19疫苗中广泛应用的Spikevax和Comirnaty都采用这种机制。然而，帽依赖性翻译在应激条件下会被抑制，而帽非依赖性翻译（cap-independent translation, CIT）在癌症、糖尿病和神经退行性疾病等病理状态下却表现出独特优势。不过，线性CIT mRNA缺乏5'帽结构的保护，其细胞内的半衰期显著缩短，翻译效率低下，且现有研究方法存在操作繁琐、易产生假阳性等问题。

近日，牛津大学和南安普顿大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究，他们通过设计一种新型叠氮修饰的二核苷酸引物CleaN3，结合点击化学对mRNA进行5'端修饰，成功解决了CIT mRNA的稳定性与翻译效率问题。该研究不仅开发了高效的分子工具，还为帽非依赖性翻译机制研究提供了新方法。

研究人员采用的关键技术方法包括：固相合成法制备CleaN3引物、体外转录（IVT） priming技术、应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）反应进行转录后修饰、流式细胞术分析mRNA摄取和翻译效率、RT-qPCR测定mRNA稳定性、超分辨率活细胞成像追踪mRNA细胞命运，以及利用人源细胞系（HEK293、HeLa、HepG2、HCT-116）进行功能验证。

CleaN3可高效固相合成

研究团队基于CleanCap共转录加帽原理，设计合成了叠氮功能化的二核苷酸引物CleaN3。采用高载量聚苯乙烯树脂进行固相合成，通过引入2'-O-甲基修饰避免复杂的去保护步骤，最终以54%的收率获得高纯度产物。该方法避免了氟化物使用，简化了纯化流程。

IVT priming with CleaN3 provides homogeneous 5'-azido-modified transcripts

实验表明，CleaN3在2-10mM浓度范围内均能高效介导转录起始，最高priming效率达97.2%。在不同长度模板（1.8-5.1kb）和不同T7启动子（φ6.5、φ2.5）条件下，CleaN3均能产生5'端均一的叠氮修饰转录本，其性能与商用CleanCap试剂相当。

CleaN3-primed transcripts can be efficiently modified post-transcriptionally

通过SPAAC反应，CleaN3修饰的转录本可与DIBAC-AF647高效结合，15分钟转化率达70%，1小时完全转化。LC-MS分析证实产物为两种区域异构体，且修饰过程不影响mRNA完整性。

Post-transcriptional 5'-modification of CIT mRNA can significantly enhance its properties

在翻译效率方面，5'-AF647修饰的iHCV-EGFP mRNA比5'-三磷酸版本提高7.6倍。稳定性实验显示，5'-AF647 mRNA的半衰期比5'-三磷酸版本延长1.4倍。免疫原性分析表明，修饰后的mRNA细胞因子诱导水平与帽化mRNA相当，且不影响细胞活力。

Post-transcriptional 5'-modification can serve as a tool for benchmarking CIT mRNAs

研究人员利用5'-AF647标记实现了mRNA摄取的精确量化，在不同细胞系中比较了三种IRES元件（iHCV、iEMCV、iSyn）的翻译效率。发现iSyn设计在HeLa细胞中效率最高，而iHCV在HCT-116细胞中表现最佳。细胞大小分析表明mRNA摄取量与细胞尺寸正相关。

Post-transcriptional 5'-modification facilitates cellular fate tracking of CIT mRNA

通过超分辨率活细胞成像，研究团队实时追踪了mRNA的细胞内存取、胞质聚焦形成和细胞分裂过程。FISH实验证实AF647信号与mRNA定位高度相关（Pearson系数>0.8）。共定位分析显示mRNA主要定位于内质网和晚期内体/溶酶体。

该研究开发的CleaN3介导的5'修饰策略成功解决了CIT mRNA稳定性差、翻译效率低和免疫原性高等关键问题。通过将测序优化与化学修饰相结合，线性CIT mRNA的翻译性能可达帽化mRNA的67倍，与环状RNA相当。这种修饰方法不仅为研究帽非依赖性翻译机制提供了强大工具，还为开发针对特定组织类型的mRNA治疗药物开辟了新途径。特别是该方法能够实现mRNA细胞命运的精确追踪和定量分析，克服了传统双顺反子载体的局限性，为未来mRNA药物的理性设计提供了重要技术支撑。

研究结果表明，通过合理的化学修饰和序列设计，线性CIT mRNA完全可以达到甚至超越现有帽化mRNA和环状RNA的治疗效果，这将极大地推动mRNA技术在肿瘤治疗、代谢性疾病和神经退行性疾病等领域的应用前景。