HIFα亚型特异性活动驱动VHL相关肿瘤发生的细胞类型特异性

《Nature Communications》：HIFα isoform specific activities drive cell-type specificity of VHL-associated oncogenesis

本研究针对VHL肿瘤抑制基因失活为何特异性诱发肾透明细胞癌（ccRCC）而非其他组织肿瘤这一关键科学问题，通过构建Vhl条件性敲除小鼠模型，结合单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术，揭示了HIF1A和HIF2A在Vhl缺失后不同肾上皮细胞中发挥截然不同的时空特异性作用：肾乳头区细胞存活依赖Hif1a共缺失，而近端小管（PT）细胞增殖需HIF1A和HIF2A共同激活；早期转录调控由双亚型共同驱动，而随后的适应性去分化则主要由HIF2A介导。该研究阐明了VHL相关肿瘤细胞类型特异性的分子基础，为ccRCC的早期干预提供了理论依据。

　　

在肿瘤生物学领域，一个长期困扰科学家的问题是：为何某些基因突变仅在特定组织或细胞类型中诱发癌症？von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因的失活就是一个典型例子。VHL基因的双等位基因失活导致低氧诱导因子（HIF）通路持续激活，并几乎唯一地与肾透明细胞癌（ccRCC）的发生相关，而ccRCC被认为起源于肾近端小管（PT）上皮细胞。然而，VHL基因在人体多种细胞类型中普遍表达，其失活为何特异性导致肾脏肿瘤，而非其他组织肿瘤，其机制尚不明确。

深入研究揭示，HIF通路包含两个关键转录因子亚型：HIF1A和HIF2A。在晚期ccRCC中，这两个亚型似乎表现出相互拮抗的作用，HIF1A被认为具有“抑癌”特性，而HIF2A则显示“促癌”活性。然而，令人费解的是，在ccRCC中仅观察到VHL的失活突变，却未发现EPAS1（编码HIF2A）的激活突变，这表明VHL失活与致癌性HIFα激活之间的关系可能更为复杂。理解VHL失活和HIFα激活在癌症发生早期的细胞类型特异性效应，对于阐明ccRCC的起源至关重要，但由于在出现可识别的形态学异常之前，难以在天然组织中识别和分析突变细胞，这一直是研究的难点。

为了解决这一挑战，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究。他们设计了一种巧妙的“致癌标签”系统，能够在肾脏组织中原位识别和分析Vhl缺失的细胞，并利用他莫昔芬诱导的Cre重组酶系统，在肾小管上皮细胞（RTE）中条件性敲除Vhl的同时，共敲除Hif1a、Epas1（编码HIF2A）或两者。通过这种策略，研究人员能够在体内以单细胞分辨率揭示Vhl失活后，两种主要HIFα亚型在肿瘤发生早期阶段所扮演的独特且有时空特异性的角色。

本研究的关键技术方法主要包括：利用他莫昔芬诱导的Pax8-CreERT2系统构建Vhl及其与Hif1a/Epas1组合敲除的小鼠模型；通过免疫组织化学（IHC）和RNA原位杂交进行组织学分析和细胞定位；采用荧光激活细胞分选（FACS）分离基因编辑细胞；以及进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）并对数据进行分析（包括差异表达分析、基因集富集分析GSEA、转录因子结合位点预测LISA/CheA3等），并利用癌症基因组图谱（TCGA）的临床ccRCC数据验证研究发现。

Vhl失活导致肾上皮细胞命运呈现区域特异性

研究人员发现，诱导Vhl失活后，不同肾脏区域的细胞表现出截然不同的命运。在肾乳头区域，Vhl缺失导致细胞大量丢失，而这种细胞丢失可被Hif1a的共敲除完全挽救，Epas1敲除则无此效应。这表明在肾乳头区，HIF1A的激活对细胞存活有负面影响，这或许解释了为何VHL相关肿瘤不起源于此区域。相反，在肾皮质和外髓质的近端小管（PT）区域，Vhl缺失不仅没有引起细胞丢失，反而导致了tdTomato阳性（即Vhl缺失）细胞的显著累积。这种累积与细胞增殖标志物Ki67共表达增加以及组织中tdTomato阳性细胞连续簇的形成相关，表明Vhl缺失促进了PT细胞的增殖。

PT细胞增殖需要HIF1A和HIF2A的共同激活

为了探究HIFα亚型在Vhl缺失诱导的PT细胞增殖中的作用，研究人员分析了共敲除Hif1a和/或Epas1的影响。结果发现，单独敲除任一HIFα亚型均显著减少了PT区域中tdTomato阳性细胞的累积比例和增殖细胞（Ki67+）的比例。同时敲除Hif1a和Epas1则几乎完全阻断了Vhl缺失引起的细胞增殖。这些数据表明，在PT细胞中，Vhl失活驱动的早期增殖需要HIF1A和HIF2A两者的共同激活，缺一不可。

HIF1A和HIF2A调控截然不同的转录程序

通过单细胞转录组分析PT S1、S2、S3段细胞，研究人员深入揭示了Vhl依赖性基因表达的HIFα亚型特异性。他们将Vhl缺失后表达发生变化的基因分为四类：HIF1A特异性、HIF2A特异性、需要HIF1A和HIF2A两者、或可由任一亚型调控的基因。分析表明，HIF1A和HIF2A特异性调控的基因集重叠很少，且富集于不同的生物学通路。HIF1A特异性调控基因显著富集于糖酵解等代谢过程，而HIF2A特异性调控基因则涉及脂质和氨基酸代谢、细胞外基质重组等通路。这表明两种HIFα亚型在Vhl缺失的PT细胞中激活了互补的、不同的生物学程序，它们的协同作用可能使细胞获得多种癌症特征。

HIF2A特异性驱动Vhl缺失PT细胞的去分化

研究人员此前发现Vhl缺失的PT细胞会随时间推移发生去分化。本研究中，他们进一步证明这种去分化现象，表现为PT段特异性标记物（如Slc5a12、Inmt、Cyp2a4）的下调，严格依赖于HIF2A，而非HIF1A。

HIFα亚型贡献具有时间依赖性

研究人员还分析了基因表达随时间的变化。发现Vhl失活后的早期转录变化由HIF1A和HIF2A近乎同等贡献。然而，随后叠加的适应性变化，包括去分化，则主要由HIF2A驱动。因此，尽管早期需要两者，但随着时间的推移，HIF2A对Vhl缺失PT细胞中基因表达改变的总体贡献远大于HIF1A。

研究发现与临床ccRCC相关

最后，研究人员证实，在Vhl缺失的PT细胞中发现的HIF1A和HIF2A特异性早期及适应性转录程序，在TCGA数据库的人类ccRCC临床样本中同样被激活，显示了这些程序在晚期疾病中的相关性。

本研究结论和讨论部分强调，Vhl失活的主要体内后果——细胞类型特异性的消亡、增殖和基因表达——均依赖于HIFα的细胞类型特异性、时间差异和亚型特异性活动。研究提供了直接证据，表明只有当Vhl失活同时调动了两种HIFα亚元的不同活动时，促癌效应才会显现。特别是在癌症相关的近端小管细胞中，早期增殖需要HIF1A和HIF2A的共同激活，它们分别调控不同的转录程序，可能协同促进肿瘤发生。此外，HIF2A在驱动随时间推移的适应性变化（如去分化）中起主导作用。这些发现解释了VHL相关肿瘤发生的细胞类型特异性，并支持了在疾病早期使用HIF2A拮抗剂（如已获批的Belzutifan）以防止潜在癌前细胞扩增的理念。未来的研究需要进一步解析HIF2A依赖性基因调控在Vhl缺失细胞中的具体作用，并检验早期抑制HIF2A能否阻止Vhl缺失的PT细胞在体内增殖。