深度学习预测多模板PCR中的序列特异性扩增效率

《Nature Communications》：Predicting sequence-specific amplification efficiency in multi-template PCR with deep learning

本研究针对多模板PCR中存在的扩增偏倚问题，开发了一种基于深度学习的预测模型。研究人员通过合成寡核苷酸池和高通量测序，系统量化了不同序列的PCR扩增效率，并利用1D-CNN模型准确识别低效扩增序列。研究发现，短序列基序通过适配体介导的自引物机制抑制扩增，这一发现为改进PCR实验设计和DNA数据存储编码策略提供了重要依据。

　　

在分子生物学研究中，聚合酶链式反应（PCR）是一项不可或缺的技术，广泛应用于基因检测、病原体诊断和高通量测序等领域。然而，当反应体系中同时存在大量不同模板时，即多模板PCR（multi-template PCR），不同序列的扩增效率存在显著差异，导致最终测序结果出现严重偏倚。这种扩增偏倚（amplification bias）不仅影响DNA数据存储的可靠性，也对代谢组学（metabarcoding）和RNA测序等定量分析产生干扰。

传统观点认为，GC含量是导致PCR偏倚的主要因素，但越来越多的证据表明，问题远比想象中复杂。为了解决这一长期存在的技术难题，来自苏黎世联邦理工学院和马克斯·普朗克研究所的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。

关键技术方法

研究人员设计了两组合成寡核苷酸池（GCall和GCfix），分别包含12,000条随机序列和GC含量固定为50%的序列。通过系列扩增和Illumina测序，量化每条序列的扩增效率。利用一维卷积神经网络（1D-CNN）结合位置编码（positional encoding）构建预测模型，并开发了CluMo（Clustering-based Motif discovery）方法进行基序发现。通过qPCR验证特定序列的扩增效率，并设计含特定基序的验证池进行外部验证。

序列扩增效率存在显著差异

研究人员通过系列PCR扩增和深度测序发现，在多模板PCR中，约2%的序列表现出极低的扩增效率。这些序列在扩增过程中逐渐被“稀释”，在经过90个PCR循环后，其相对覆盖率下降至不足10%。通过比较固定GC含量和可变GC含量的两组序列，研究人员发现GC含量本身并不能完全解释扩增效率的差异，表明存在其他更为复杂的序列特性影响因素。

位置序列信息对预测扩增效率至关重要

为了探究导致某些序列扩增效率低下的原因，研究人员比较了多种机器学习模型的预测性能。结果显示，传统基于GC含量和碱基频率的逻辑回归模型预测准确度接近随机分类器，表明单纯的碱基组成无法解释扩增效率差异。而结合位置编码的1D-CNN模型表现最佳（AUROC>0.8），显著优于其他模型，说明扩增效率与序列中位置特定的特征密切相关。

发现与低PCR效率相关的位置基序

通过CluMo方法，研究人员从训练好的1D-CNN模型中发现了多个与低扩增效率显著相关的短序列基序。这些基序大多包含CGTG子序列，并且在低效扩增序列中倾向于出现在序列起始位置（靠近引物结合位点）。通过基序替换实验，研究人员证实这些基序对模型的预测性能至关重要，替换后模型性能显著下降至基线水平。

适配体介导的自引物抑制模板扩增

机制研究表明，发现的基序与PCR适配体（adapter）序列存在短互补区，能够形成发夹结构（hairpin），从而引发自引物（self-priming）。这种适配体介导的自引物机制抑制了引物退火，导致扩增效率下降。热力学分析表明，即使在高至54-60°C的PCR退火温度下，这些短基序（4-6 nt）形成的发夹结构仍然稳定，与引物退火竞争。

模型在文献数据集上的泛化性评估

研究人员在不同文献数据集上评估了模型的泛化能力，发现预测性能高度依赖于实验条件（如聚合酶类型和适配体序列）。使用相同实验条件的数据集间模型转移性较好，而条件不同的数据集间预测性能较差。这一发现强调了PCR偏倚的工作流程依赖性特征，不同实验条件可能导致不同类型的扩增效率问题。

模型性能和基序效应的外部验证

通过外部实验室设计的验证池（包含10,000条随机序列和2,000条含特定基序的序列），研究人员验证了模型的稳健性和基序效应。在相同实验条件下，模型预测性能与内部验证相当（AUROC约0.8）。特定基序（如TCGTGT）在序列末端引入时，可导致扩增效率下降4.8±2.4%，相当于每14个循环相对丰度减半。与现有过滤方法相比，1D-CNN过滤能更有效地减少低覆盖率序列，将实现99%序列回收率所需的测序深度降低四倍。

研究结论与意义

本研究通过结合高通量实验和深度学习，系统揭示了多模板PCR中序列特异性扩增偏倚的分子机制。研究发现，短序列基序通过适配体介导的自引物机制显著影响扩增效率，且这种效应具有位置依赖性。开发的1D-CNN预测模型和CluMo基序发现方法不仅为理解PCR偏倚提供了新视角，也为改进实验设计提供了实用工具。

该研究的创新点在于首次系统揭示了短序列基序在PCR偏倚中的关键作用，并提出了适配体介导的自引物这一新机制。相比传统的GC含量约束，基于深度学习的序列筛选能更有效地减少扩增偏倚，提高DNA数据存储的可靠性。这些发现对依赖PCR的各类应用，包括基因组学、诊断学和合成生物学等领域具有重要指导意义。

未来，这种基于深度学习的预测框架有望应用于更广泛的PCR条件优化和序列设计场景，为高通量测序技术的精准化提供新思路。同时，研究发现的工作流程依赖性特征也提示，在不同实验条件下可能需要特定的模型优化和验证。