利用3D生物打印人皮肤等效模型突破阿昔洛韦局限并鉴定强效抗HSV病毒药物

《Nature Communications》：Limitations of acyclovir and identification of potent HSV antivirals using 3D bioprinted human skin equivalents

本研究针对阿昔洛韦(acyclovir)在抑制HSV亚临床排毒和耐药性方面的局限性，开发了3D生物打印人皮肤等效模型(HSE)高通量筛选平台。研究人员通过对738种化合物进行筛选，鉴定出41种候选抗病毒药物，其中23种为已知或实验性HSV治疗药物。研究发现靶向HSV解旋酶-引物酶或宿主复制通路的抗病毒药物在多种细胞模型中都表现出稳定效力，揭示了细胞类型特异性药效差异机制。该研究为HSV药物发现提供了更生理相关的筛选体系，推动了个体化药物开发进程。

　　

单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus, HSV)感染是全球性的公共卫生问题，影响着三分之二的人口。HSV-1和HSV-2不仅引起反复发作的口腔和生殖器溃疡疾病，还会导致新生儿疱疹，死亡率高且可能造成严重的神经系统损伤。更令人担忧的是，HSV-2感染还会增加人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的风险，据估计每年140万新发HIV感染中约有42万例可归因于HSV-2感染。

尽管在动物研究中取得了一定成功，HSV-2疫苗在人体试验中却屡屡受挫。阿昔洛韦(acyclovir)作为HSV感染的主要治疗药物，虽能减轻疾病严重程度和缩短发作持续时间，但在免疫缺陷患者中会出现耐药性问题，对预防亚临床复发效果有限，也无法解决HIV传播风险增加的问题。因此，开发新的治疗策略和抗病毒药物迫在眉睫。

传统药物开发严重依赖二维(2D)细胞单层和动物模型来评估药物安全性和有效性。常规体外培养的细胞单层虽然便于快速进行感染性检测，但无法重现天然组织中复杂的细胞-细胞和细胞-基质相互作用。因此，这些细胞检测通常无法准确预测药物在人体中的反应。动物模型在预测价值和与人类生物学相关性方面也存在不足，这从药物候选物从I期到III期临床试验的高失败率中可见一斑。

三维(3D)体外模型能够高度模拟人体组织和器官，为克服当前药物研发平台临床预测性局限提供了新机遇。生物工程组织填补了现有细胞和动物模型与复杂人体生理之间的空白，为加速药物发现、毒性筛选和临床前测试提供了强大平台。这些体外人体组织模型设计用于复制体内器官的关键特征，如细胞类型组成、3D微结构、功能性组织界面和器官特异性微环境。

皮肤和黏膜屏障是HSV初始感染和再激活后病毒复制的主要组织。皮肤组织由表皮、真皮和皮下层组成，形成保护机体免受病原体和有害环境物质侵害的物理屏障。表皮主要由角质形成细胞(keratinocytes)组成，这些细胞能够分化成复层，从最内层的基底层到最外层的角质层。对复发性HSV感染的人体活检研究表明，真皮-表皮连接处(DEJ)的基底角质形成细胞通过感觉神经支配和神经突延伸到DEJ，成为HSV再激活的复制靶标。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员开发了生物打印的人皮肤等效模型(HSE)，这些模型在气液界面(ALI)分化为复层表皮。他们实施了使用3D生物打印HSE的高通量筛选(HTS)，利用HSV-GFP报告病毒和高内涵成像技术。该3D生物打印检测平台鉴定出了强效抗病毒化合物，包括23种已知的抗HSV候选药物。

研究人员使用了几项关键技术方法：首先建立了3D生物打印人皮肤等效模型(HSE)平台，使用商业来源的新生儿细胞和成人供体来源的原代细胞；开发了基于96孔板格式的高通量筛选系统；利用HSV-1 K26-GFP报告病毒和tdTomato标记的成纤维细胞进行实时监测；采用高内涵成像和自动化图像分析技术；并进行了二维和三维模型的对比药效评估。

Assessment of HSV susceptibility and acyclovir antiviral potency across different cell types

研究人员从六名供体采集皮肤穿刺活检样本，分离获得供体特异性的角质形成细胞和真皮成纤维细胞进行匹配比较。通过实时监测重组株HSV-1 K26感染的GFP荧光表达，发现GFP表达在角质形成细胞、成纤维细胞和Vero细胞中分别于感染后20、48和36小时达到峰值。GFP初始检测时间在角质形成细胞中(6.0 HPI)显著早于成纤维细胞(7.9 HPI)。角质形成细胞中的GFP表达增加速度远快于成纤维细胞和Vero细胞，最大GFP倍增率分别为每小时2.23±0.41、1.37±0.39和1.00±0.15。这些结果表明HSV感染和病毒基因表达在角质形成细胞中比在供体匹配的成纤维细胞或Vero细胞中发生得更快。

剂量反应曲线显示，阿昔洛韦在角质形成细胞中的效力显著低于在所有六名供体的成纤维细胞中的效力。阿昔洛韦抑制50%病毒编码GFP表达所需的浓度(IC₅₀)在角质形成细胞中(67.7±18.2μM)平均比在成纤维细胞中(0.40±0.2μM)高196.7倍，比在Vero细胞中(1.14±0.2μM)高60.2倍。杀死50%靶细胞所需的细胞毒性浓度(CC₅₀)在供体来源的角质形成细胞和成纤维细胞中均超过600μM，表明抗病毒效力的差异不是由细胞毒性引起的。

Development of HSV infection assays on 3D bioprinted human skin equivalents

研究人员开发了3D生物打印的人皮肤等效模型(HSE)，创建了生理相关的体外人体皮肤模型用于抗病毒筛选。将含有明胶、胶原蛋白、纤维蛋白和新生儿人成纤维细胞的水凝胶使用基于柱塞的3D生物打印机打印到96孔transwell插入件的顶端。真皮组织经过7天成熟后，将新生儿人角质形成细胞接种在上面，并在表皮化培养基中浸泡7天。为诱导角质形成细胞分化和表皮分层，将组织使用定制的3D打印适配器提升至气液界面(ALI)，并在真皮基底表面用角质化培养基培养7天。

H&E染色证实ALI培养产生了具有真皮和分化表皮的HSE，包括基底层、棘层、颗粒层和角质层。免疫组化(IHC)染色显示细胞角蛋白10(K10)和细胞角蛋白14(K14)分别表达于基上层和基底层，loricrin和flaggrin分别表达于颗粒层和角质层，表明分化正确的表皮类似于体内人体皮肤结构。

Implementation of a primary drug screen using 3D bioprinted human skin tissue equivalents

研究人员使用3D生物打印HSE检测平台对738种具有广泛靶点和作用机制的化合物进行了筛选。主要筛选在沉浸式和ALI感染模型中测试了化合物库，化合物浓度为10μM，重复实验，使用了3,840个生物打印的HSE组织。每个板包含对照孔：阴性对照(HSV-1+DMSO)、抑制剂对照(培养基-HSV-1)和已知化合物(HSV-1+ACV(0.2μM))。

通过计算中位Z'因子评估检测的稳健性，沉浸式模型的Z'为0.57，ALI模型的Z'为0.13，表明沉浸式检测非常稳健，而ALI检测中等稳健，证明3D生物打印检测平台适用于高通量筛选。研究人员将"命中"化合物定义为那些抑制GFP表达(HSV-1活性)至少15%且不引起tdTomato荧光(成纤维细胞活力)减少超过50%的化合物，从初筛中选出了106种化合物。

Secondary drug testing with 3D bioprinted human skin equivalents

对106种选定的"命中"化合物在沉浸式和ALI模型中进行了从10μM到0.04μM的剂量反应二次筛选。发现在沉浸式模型中有46%的化合物，在ALI模型中有70%的化合物在测试的最高浓度下使GFP表达减少至少50%，且不使tdTomato信号减少50%。测试的化合物根据其效价(IC₅₀)和效能(最大百分活性)按浓度反应曲线(CRC)等级进行分类。

化合物如果在其抗病毒活性CRC等级为-1.n或-2.n，且成纤维细胞活力的CRC等级为4，则被认为是候选抗病毒药物。最终确定了41种候选抗病毒药物，并按作用机制分组。作用机制聚类表明，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(8%)和蛋白酶抑制剂(8%)在沉浸式模型中更为普遍，而DNA聚合酶抑制剂(13%)在ALI模型中更为普遍。蛋白酶体、DNA聚合酶、Casein Kinase 2、Exportin-1、GBF-1和Ribonucleotide-Reductase的抑制剂在两种模型中均有效。

Assessment of the candidate antiviral activities in donor-derived keratinocytes and fibroblasts

研究人员在供体来源的原代角质形成细胞和成纤维细胞的2D单层培养中进一步研究了11种顶级候选抗病毒药物的细胞类型特异性效应。所有11种候选抗病毒药物在角质形成细胞中的效力均高于阿昔洛韦(7到>884倍)，IC₅₀值范围为0.08到9.9μM。五种候选抗病毒药物——amenamevir、pritelivir、gemcitabine、lanatoside-C和SNX-2112——在成纤维细胞中的抗病毒效力也超过了阿昔洛韦，IC₅₀值范围为0.05到0.15μM。

8种化合物在供体匹配的皮肤细胞中，角质形成细胞和成纤维细胞之间的抗病毒效力存在显著差异。然而，候选抗病毒药物的差异小于阿昔洛韦(分别<27倍 vs >220倍)。两个明显的例外是verdinexor和fimepinostat，它们在角质形成细胞中抑制病毒GFP表达至少50%，但无法可靠地抑制成纤维细胞中的病毒GFP表达。

Comparison of candidate antivirals in 2D monoculture versus 3D bioprinted human skin equivalents

比较了四种模型中顶级候选化合物的效力、毒性和选择性指数：2D角质形成细胞、2D成纤维细胞、3D沉浸式和3D ALI。细胞类型和2D:3D模型类型对抗病毒效力的影响是化合物特异性的。阿昔洛韦受细胞类型和2D:3D环境影响最显著，而lanatoside C mor和SNX-2112不受影响。沉浸式单层组织和角质形成细胞表现出比ALI组织和成纤维细胞更相似的效力，这很可能是由于沉浸式模型中感染的未分化单层角质形成细胞所致。

Generation of 3D bioprinted human skin equivalents using adult donor-derived skin cells

研究人员使用新生儿人真皮成纤维细胞生物打印真皮，然后将供体#3的角质形成细胞接种在真皮上，生成供体特异性的HSE。沉浸式和ALI HSE的H&E染色显示，供体来源的角质形成细胞在成人来源的ALI模型中成功发育为复层表皮，并通过IHC检测到正确的K10和K14表达。大多数11种候选抗病毒药物在新生儿来源和成人供体来源的HSE中显示出相似的IC₅₀值。

本研究强调了阿昔洛韦在不同细胞类型中对HSV表现的敏感性存在关键差异，以及这种广泛使用的抗疱疹药物在治疗效果上的局限性。研究人员证明了阿昔洛韦在抑制角质形成细胞中的HSV感染方面效力显著低于在成纤维细胞或Vero细胞中的效力。而角质形成细胞正是HSV再激活和外周感染过程中遇到的主要细胞类型。

研究建立的高通量检测平台利用3D生物打印快速生成超过6500个人皮肤等效物(HSE)，能够识别强效的HSV抗病毒化合物。3D生物打印的HSE重现了体内皮肤结构，包括表皮、真皮和真皮-表皮连接处。使用表达GFP的HSV-1菌株和表达tdTomato的成纤维细胞使平台能够快速筛选效力、效能和细胞毒性。

这项工作强调了在药物发现和开发中应用生理相关检测的重要性。研究表明抗病毒化合物的效力和效能在不同细胞类型和2D与3D环境之间可能存在显著差异，阿昔洛韦在角质形成细胞中的效力降低就最好地说明了这一点。这种细胞类型特异性的药效差异可能解释了为什么阿昔洛韦治疗不能消除亚临床排毒、相关的HSV传播以及HIV感染风险增加。

多模型药物筛选和评估策略也为HSV抗病毒药物开发提供了见解。数据显示，像amenamevir和pritelivir这样抑制HSV解旋酶-引物酶的药物在测试的2D角质形成细胞、2D成纤维细胞、3D沉浸式和3D ALI模型中都具有高度选择性，并且对HSV-1和HSV-2菌株表现出相似的效力。

这项研究的发现对HSV治疗策略具有重要启示。针对病毒DNA合成的药物通常在所有测试模型中有效，但阿昔洛韦在角质形成细胞中的效力明显低于在成纤维细胞中的效力，这在2D单层培养和3D生物打印HSE中都得到了证明。未来的研究需要揭示这些机制，以改进抗病毒策略。

研究人员开发的3D生物打印HSE检测平台不仅能够用于高通量药物筛选，还能整合患者来源的细胞，允许在药物发现的早期阶段包括多个具有不同年龄、性别、血统和遗传背景的供体，以提高下游临床试验的成功率。这一平台为HSV药物发现提供了更生理相关的方法，将推动更有效的抗病毒药物的开发，有望解决当前HSV治疗中的未满足需求。