基于肌肉特异性病毒样颗粒的基因编辑疗法治疗杜氏肌营养不良症

《Nature Communications》：Muscle-specific gene editing therapy via mammalian fusogen-directed virus-like particles

本研究针对肌肉遗传疾病治疗中基因编辑工具全身递送的挑战，开发了利用肌肉融合蛋白(Myomaker/Myomerger)修饰的病毒样颗粒(MuVLPs)递送系统。通过系统性给药可实现骨骼肌特异性基因编辑，在DMD模型小鼠中成功恢复肌营养不良蛋白表达，显著改善运动功能。该研究为肌肉疾病精准治疗提供了新策略。

　　

肌肉是维持人体运动功能的核心组织，当肌肉细胞中的基因出现缺陷时，会导致一系列严重的遗传性肌肉疾病，其中杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是最常见的一种。这种疾病由于Dmd基因突变导致肌营养不良蛋白(dystrophin)缺失，患者会出现进行性肌肉萎缩和无力，最终因呼吸衰竭而早逝。传统的基因治疗方法面临巨大挑战——如何将基因编辑工具精准地递送到遍布全身的骨骼肌细胞中，同时避免对其他组织造成影响？

目前，病毒载体如腺相关病毒(AAV)虽然能够递送CRISPR-Cas9系统，但存在长期表达、潜在免疫原性和脱靶效应等问题。而病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)作为一种非病毒递送系统，能够携带预组装的CRISPR-Cas9核糖核蛋白(ribonucleoproteins, RNPs)，实现瞬时基因编辑，大大降低了脱靶风险。然而，现有的VLPs缺乏针对骨骼肌的特异性靶向能力，这成为限制其临床应用的主要障碍。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，华南理工大学的研究团队开发了一种创新的解决方案——肌肉特异性病毒样颗粒(muscle-specific virus-like particles, MuVLPs)。这项研究的灵感来源于肌肉细胞特有的融合机制。肌肉发育过程中，两种关键的肌肉融合蛋白——Myomaker和Myomerger，负责介导成肌细胞的融合过程。研究人员巧妙地将这两种蛋白工程化到VLPs的表面，创建了能够特异性靶向骨骼肌细胞的递送平台。

研究团队采用的主要技术方法包括：基于HIV-1 Gag蛋白的病毒样颗粒构建、肌肉融合蛋白伪型化技术、体外膜融合特异性验证、DMD小鼠模型体内疗效评估，以及通过基因组编辑效率定量分析、肌肉功能学测试和病理组织学检查等多维度评价体系。实验使用的B10-Dmd-KO小鼠模型来源于江苏集萃药康生物技术有限公司。

Engineering the skeletal muscle-specific delivery platform MuVLPs

研究人员首先成功构建了MuVLPs系统。该平台以HIV-1的Gag多蛋白为核心结构，通过共转染HEK-293T细胞表达Gag-Pol、肌肉融合蛋白(Myomaker和Myomerger)以及负载蛋白，制备出粒径为100-150纳米的球形颗粒。

Western blotting分析证实颗粒表面成功展示了肌肉融合蛋白，体外实验显示MuVLPs能够特异性与表达Myomaker/Myomerger的细胞发生膜融合，融合效率达到69%，而对照组的VSVG-VLPs虽然融合效率高但缺乏特异性。

MuVLPCre induces skeletal muscle cell-specific gene recombination

为验证MuVLPs的功能性递送能力，研究团队构建了携带Cre重组酶的MuVLPCre。在B6-G/R;B10-Dmd-KO报告基因小鼠模型中，系统性给药后，MuVLPCre特异性地在骨骼肌组织中诱导基因重组，其中膈肌的转导效率达到40%，而在心脏、肝脏等非肌肉组织中未检测到活性，证明了其卓越的组织特异性。

MuVLPCas9 enable selective excision of Dmd exon 4 in muscle cells

研究人员进一步开发了携带Cas9/sgRNA RNP的MuVLPCas9，用于治疗DMD。通过筛选最优的sgRNA对，他们成功实现了Dmd基因第4外显子的特异性切除。

ELISA分析显示每个MuVLPCas9颗粒包裹约11个Cas9分子，体外实验证实其能够特异性编辑表达肌肉融合蛋白的细胞，成功删除突变外显子。

In vivo skeletal muscle-specific gene editing with MuVLPCas9 treats dystrophy in a mouse model for DMD

在DMD模型小鼠中，系统性给予MuVLPCas9显著改善了疾病表型。治疗组小鼠的抓力从6.1g/g提升至7.5g/g，达到野生型水平的72%；跑步耐力时间从16.9分钟延长至24.3分钟。更重要的是，血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)水平从1513.2 U/L降至309.7 U/L，表明肌肉损伤得到显著改善。

Western blotting和免疫荧光分析证实，治疗组小鼠多个骨骼肌组织中恢复了肌营养不良蛋白表达，且基因编辑仅发生在骨骼肌组织，非肌肉组织中未检测到编辑活性。

剂量效应研究显示，随着MuVLPCas9剂量从5.5×10¹⁰增加至1.7×10¹¹颗粒，基因编辑效率和治疗效果呈剂量依赖性提升。高剂量治疗显著减少了肌肉组织中中央核纤维比例（膈肌从73.71%降至25.10%）和纤维化面积（膈肌从20.78%降至3.29%），进一步验证了其治疗潜力。

讨论与展望

该研究成功建立了基于哺乳动物融合蛋白导向的病毒样颗粒平台，实现了骨骼肌特异性的基因编辑治疗。与传统的病毒载体相比，MuVLPs结合了非病毒载体的安全性和肌肉特异性靶向的优势，为DMD等肌肉遗传疾病的治疗提供了新思路。

然而，研究也发现当前MuVLPs系统对心肌细胞的编辑效率有限，这可能是由于成熟心肌细胞中Myomaker/Myomerger表达量较低所致。鉴于心肌病是DMD患者死亡的主要原因之一，未来需要进一步优化系统以提高对心脏组织的靶向能力。

这项研究不仅为肌肉疾病治疗提供了有效平台，更重要的是展示了一种利用细胞自身融合机制实现组织特异性递送的新策略。通过进一步优化MuVLPs设计和探索更多细胞膜融合蛋白，这一平台有望扩展到其他需要组织特异性递送的疾病治疗领域，为基因编辑疗法的临床应用开辟了新途径。