生物分子凝聚体与网格蛋白协同调控内吞囊泡形成的机制研究

《Nature Communications》：Of condensates and coats - reciprocal regulation of clathrin assembly and the growth of protein networks

本研究揭示了内吞起始蛋白Eps15通过相分离形成生物分子凝聚体，并作为动态平台促进网格蛋白（clathrin）在生理pH条件下自组装成具有特征曲率的篮状结构。研究发现，Eps15无序区与网格蛋白重链N端结构域的直接相互作用驱动了凝聚体介导的网格蛋白组装，而AP2复合物进一步强化了这一过程。同时，网格蛋白组装通过表面活性剂样行为稳定凝聚体并限制其尺寸，形成尺寸均一（约85 nm）的功能性囊泡前体。该工作发表于《Nature Communications》，为理解细胞内吞过程中膜重塑与蛋白自组织的协同机制提供了新范式。

　　

细胞通过内吞作用（endocytosis）精准调控物质运输，其中网格蛋白包被囊泡（clathrin-coated vesicle）的形成是核心环节。传统模型认为，网格蛋白在适配蛋白（如AP2）辅助下于细胞膜特定区域组装成篮状结构，驱动膜变形并最终掐断形成囊泡。然而，这一过程如何在水相环境中快速启动并控制尺寸均一性仍是未解之谜。近年来，生物分子凝聚体（biomolecular condensate）作为细胞内无膜细胞器的重要形成机制，被发现在多种细胞过程中发挥组织作用，但其是否参与内吞调控尚不明确。

为解决上述问题，Jeanne C. Stachowiak团队在《Nature Communications》发表研究，揭示了内吞起始蛋白Eps15通过液-液相分离（liquid-liquid phase separation）形成凝聚体，进而协同网格蛋白完成定向组装与尺寸控制的分子机制。研究发现，Eps15在生理pH（7.5）下可自发形成微米级凝聚体，而网格蛋白三脚复合体（triskelion）可主动分配至凝聚体内部，并在其表面组装成典型网格蛋白 lattice（晶格）及篮状结构。进一步通过核磁共振（NMR）技术鉴定出Eps15无序区（intrinsically disordered region, IDR）与网格蛋白重链N端结构域（TD40）直接相互作用，驱动了pH依赖性组装。值得注意的是，凝聚体环境可显著增强AP2复合物对网格蛋白的招募能力，而Fcho2通过构象切换进一步激活AP2的起始功能。更为关键的是，网格蛋白组装会以表面活性剂（surfactant）方式限制凝聚体生长，将其尺寸稳定在约85 nm的均一水平，与生理性囊泡尺寸一致。

本研究关键技术包括：蛋白质纯化与荧光标记、共聚焦显微镜动态观测凝聚体形成与融合、荧光漂白恢复（FRAP）分析蛋白流动性、透射电镜（TEM）解析网格蛋白组装结构、核磁共振波谱（NMR）鉴定蛋白相互作用位点、动态光散射（DLS）测定颗粒尺寸分布等。

Eps15凝聚体促进网格蛋白在生理pH下组装

通过体外重构实验，发现Eps15在3% PEG 8000诱导下形成液态凝聚体，而网格蛋白三脚体在pH 7.5时主动富集于凝聚体内部，并在其表面自发组装成晶格结构。电镜结果显示，凝聚体表面覆盖的网格蛋白 basket（篮状结构）直径（85±12 nm）与酸性pH（6.8）下直接组装的basket（87±10 nm）无显著差异，表明网格蛋白固有曲率偏好主导了组装过程。

Eps15无序区与网格蛋白直接互作驱动组装

核磁共振滴定实验表明，Eps15的C端无序区（残基761-896）与网格蛋白重链N端结构域（TD40）结合后引起化学位移扰动，且结合模式呈多价、低亲和特性。突变实验进一步验证该相互作用对凝聚体介导的网格蛋白组装至关重要。

AP2与Fcho2增强凝聚体介导的网格蛋白招募

在Eps15-Fcho2-AP2三元复合物形成的凝聚体中，网格蛋白更易在 periphery（边缘）形成 excluded shell（排斥壳），且AP2β hinge-ear（AP2β_HE）结构域可通过暴露 clathrin-binding box（网格蛋白结合盒）强化这一过程。Fcho2作为构象开关，显著提升AP2激活网格蛋白组装的效率。

网格蛋白组装反向调控凝聚体稳定性与尺寸

当网格蛋白与Eps15以1:1比例共存时，凝聚体生长被抑制，尺寸稳定在244±8 nm（DLS测定）。临界温度（T_c）实验表明，网格蛋白使凝聚体热稳定性从32℃提升至37℃，证实其表面活性剂样功能可通过降低界面能阻止凝聚体过度扩张。

本研究首次阐明了生物分子凝聚体与网格蛋白组装间的双向调控机制：Eps15凝聚体为网格蛋白提供定向组装平台，而网格蛋白通过固有曲率限制凝聚体尺寸，形成功能性的囊泡前体结构。该发现不仅深化了对内吞起始分子逻辑的理解，更为生物分子凝聚体调控膜运输过程提供了全新范式，对探索细胞内无膜细胞器与膜细胞器交叉对话具有广泛意义。