工程化精简病毒样颗粒实现可编程组织特异性基因递送

《Nature Communications》：Engineering a streamlined virus-like particle for programmable tissue-specific gene delivery

本刊推荐：研究人员针对病毒样颗粒(VLPs)靶向性有限的问题，开发了基于Semliki Forest Virus(SFV)的可编程VLP载体。通过理性肽段插入或假型化改造包膜蛋白(Env)，成功获得增强血脑屏障(BBB)穿透、逃避中和抗体(Nab)及肌肉靶向的VLP变体。该载体可递送mRNA(500bp-10kb)、蛋白质及核糖核蛋白(RNP)，为组织特异性基因治疗提供了灵活平台。

　　

在生物医学领域，瞬时基因递送载体已成为重要工具，其中病毒样颗粒(VLPs)因其兼具病毒和非病毒载体优势而备受关注。尽管现有VLP在肝脏、眼睛和大脑等器官的递送中展现出潜力，但其靶向范围有限，难以有效递送至特定组织（如中枢神经系统），这严重限制了其广泛应用。此外，当前基于逆转录病毒的VLP系统因需要多种病毒蛋白参与组装而面临工程挑战。为了解决这些问题，研究人员开始探索如何通过工程化改造开发具有可编程靶向能力的VLP载体。

为了突破这些限制，中国科学院动物研究所的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项研究，他们选择正链RNA病毒Semliki Forest Virus(SFV)作为骨架，通过精简病毒成分和工程化改造，开发了一种具有可编程靶向能力的VLP载体系统。该载体不仅能够递送不同大小的mRNA、蛋白质和核糖核蛋白复合物，还能通过理性设计改变其组织靶向特性。

研究团队采用了几项关键技术方法：一是基于SFV骨架定制最小化病毒成分的VLP系统，仅保留衣壳蛋白(C protein)和包膜蛋白(Env)；二是通过理性肽段插入和假型化策略改造Env蛋白，改变VLP的靶向特性；三是利用Ai9转基因小鼠模型评估体内递送效率；四是通过体外血脑屏障模型（包括transwell和BBB球体模型）验证VLP的穿透能力；五是使用免疫荧光、电镜(TEM)和纳米粒子追踪分析(NTA)等多种技术表征VLP特性。

Customization and simplification of the SFV-based VLP system

研究人员首先对基于SFV的VLP系统进行了定制和简化。通过系统发育分析RNA病毒并考虑基因组大小、免疫原性和遗传操作便利性等因素，最终选择了Togaviridae家族的甲病毒——Semliki Forest Virus(SFV)作为工程化基础。为了降低工程难度和潜在安全风险，他们最大限度地减少了病毒来源的成分，删除了所有病毒蛋白编码序列，确保mRNA货物仅包含与衣壳C蛋白结合相关的最少量病毒序列。

Transient in vitro delivery efficiency

研究人员评估了VLP载体在细胞系上的RNA和蛋白质生产窗口期。结果显示，递送后2小时内即开始产生RNA和蛋白质，瞬时RNA和产生的蛋白质可持续长达96小时。VLP载体在不同人源和啮齿类细胞系中均表现出剂量依赖性的广泛体外递送能力，在难转染细胞系中的表现优于AAV9和LipofectamineTM。

VLP carries diverse cargo without shape change

天然SFV基因组大小约为11.8kb，因此基于SFV的VLP载体理论上具有约10kb的mRNA货物大小限制。研究人员构建了不同长度的递送基因，从500bp的GFP到10kb的CRISPRoff工具，所有大小的货物都观察到有效包装。通过PacBio长读长测序证实了5.6kb和9.2kb货物的全长序列，证明了在这些长度下mRNA的成功包装和完整性。

Immune responses in mice and prevalence of pre-existing antibodies

研究表明，SFV的大部分免疫原性来自其非结构蛋白(NSPs)。删除NSPs后，VLP引起免疫相关基因（RIG-I、MDA5、IFNA和IFNB1）的表达显著降低，表明最小VLP配置降低了免疫原性。静脉注射VLP载体确实诱导了中和抗体的产生，但六周后第二次给药时，尽管中和抗体水平较低，第二次给药仍然无效。

Engineering Env for brain targeting and liver detargeting

先前研究表明SFV具有中枢神经系统感染性，研究人员通过理性肽段插入改造Env蛋白，特别是E1蛋白。根据以往研究，E1 DIII的K345和K347在与VLDLR结合过程中与D139形成盐桥起着重要作用。他们通过在E1中插入肽段构建了变体，包括来自天然蛋白质的肽段或通过噬菌体展示筛选的肽段，以及靶向脑血管内皮细胞受体的抗体片段。

Engineering Env for expanded in vitro targeting or muscle tropism

研究人员还通过假型化扩展了VLP的靶向能力。用水泡性口炎病毒(VSV)的包膜蛋白Vsv-g替换Env，构建了工程化VLP.Vsv-g。体外效率评估表明VLP.Vsv-g以剂量依赖性方式保持效力，表明VLP系统通过假型化其他病毒的包膜蛋白具有适应性。VLP.Vsv-g在小鼠和非人灵长类PBMCs中表现出比原始SFV-Env高得多的递送效率，表明VLP的靶向能力确实发生了可编程变化。

研究还进一步用肌肉特异性哺乳动物融合蛋白Myomaker和Myomerger替换Env，构建了VLP.Myok/Myog进行体内验证。肌肉内注射证实了在肌肉细胞中的转基因产生，展示了修饰后VLP载体的潜在肌肉靶向能力。全身给药后的结果显示肌肉靶向显著增强，在膈肌中观察到最高的递送效率（约60%），其次是腓肠肌和股四头肌（约30%）；在其他组织中未检测到明显信号。

研究结论表明，研究人员成功精简了VLP系统，并基于此简化平台开发了可编程VLP载体。这种方法可能适用于其他低免疫原性VLP，增强它们的靶向性和效率，如SEND系统。可编程VLP载体具有创新工程能力，为各种治疗策略提供了多功能平台。其可定制性为推进未来的治疗策略带来了希望。

讨论部分强调，这项研究的进展为基因治疗领域提供了重要的技术突破。通过SFV骨架的精简和工程化改造，研究人员成功创建了一个灵活、可编程的基因递送平台，能够实现组织特异性的高效递送。特别是Env-P11变体在增强血脑屏障穿透和减少肝脏靶向方面的表现，为神经系统疾病的基因治疗提供了新的可能性。同时，通过假型化策略实现的靶向能力扩展和中和抗体逃避能力，为重复给药和个性化治疗奠定了基础。这种可编程VLP系统的开发不仅推动了基因递送技术的发展，也为未来精准医疗提供了重要的工具平台。