LINC00917通过调控miR-491-5p/FOXP4轴促进乳腺癌骨转移的机制研究

《Breast Cancer: Targets and Therapy》：LINC00917 Promotes Bone Metastasis of Breast Cancer by Targeting the miR-491-5p/FOXP4 Axis

本研究揭示了长链非编码RNA LINC00917在乳腺癌骨转移中的关键作用。文章证实LINC00917通过作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miR-491-5p，进而上调转录因子FOXP4的表达，最终促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及破骨细胞分化。该发现为乳腺癌骨转移的预后评估和靶向治疗提供了新的潜在生物标志物（Biomarker）和治疗靶点。

　　

Abstract

目的 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。晚期患者常发生远处转移，其中骨转移发生率较高，严重影响患者生活质量和预后。LINC00917可能与乳腺癌患者预后相关。本研究旨在探讨LINC00917是否通过靶向调控miR-491-5p的表达在乳腺癌骨转移中发挥重要作用。

患者与方法 招募了254名乳腺癌患者。通过RT-qPCR检测LINC00917的水平。此外，使用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析评估LINC00917表达与患者预后的关联。建立体外细胞模型，并进行CCK-8和Transwell实验以探讨LINC00917在乳腺癌骨转移中的作用。另外，使用双荧光素酶报告基因实验检测LINC00917、miR-491-5p和FOXP4之间的相互作用。

结果 LINC00917在乳腺癌骨转移中表达上调，且与不良预后相关。此外，敲低LINC00917抑制了乳腺癌细胞的功能，抑制了破骨细胞生成，同时促进了成骨细胞分化。而且，抑制miR-491-5p可抵消LINC00917敲低对细胞模型的影响。此外，FOXP4可能是miR-491-5p的靶基因。

结论 LINC00917是乳腺癌骨转移的潜在预后指标。提出LINC00917可能通过调控miR-491-5p/FOXP4轴促进乳腺癌的骨转移过程。

Introduction

晚期乳腺癌常发生骨转移，存在于75-85%的转移性乳腺癌女性患者中。乳腺癌的早期发现显著提高了成功治疗的可能性。然而，一旦发生转移性疾病，患者的预后会严重恶化。具体而言，骨转移患者通常面临严峻的预后，并伴有骨骼相关事件（SREs）风险升高。这些事件包括一系列衰弱状况，如病理性骨折、严重骨痛和活动能力受损。尽管双膦酸盐和地舒单抗能有效减少骨相关并发症的发生，但某些骨转移仍会对双膦酸盐治疗表现出原发性或获得性耐药。因此，需要识别新的治疗靶点，特别是针对溶骨性骨转移，这可能有助于该疾病临床管理的进步。

研究发现长链非编码RNA（lncRNA）在乳腺癌的预后和转移中起关键作用。例如，SNHG1作为M2巨噬细胞极化的调节因子促进乳腺癌进展。此外，升高的PCNAP1预示乳腺癌不良预后。值得注意的是，多种lncRNA介导乳腺癌骨转移的进展，如SNHG3、TRG-AS1和MIR193BHG。研究发现LINC00917在椎间盘退变患者中表达增强。此外，LINC00917有潜力作为肺癌的诊断生物标志物。而且，有研究报道LINC00917可能作为乳腺癌患者生存的预后因素。然而，LINC00917在乳腺癌骨转移患者中的作用仍属未知。

近年来，对miR-491-5p在癌症中的作用进行了大量实验研究。研究表明miR-491-5p能够抑制细胞生长、侵袭和转移。miR-491-5p在胰腺癌中表达降低。miR-491-5p通过抑制胃细胞的生物学功能发挥其肿瘤抑制功能。此外，miR-491-5p在结直肠癌中表现出肿瘤抑制功能，并能有效阻止乳腺癌细胞的迁移和侵袭。然而，miR-491-5p在乳腺癌骨转移中的作用及其与LINC00917的关系尚未得到验证。

FOXP4在各种恶性肿瘤的进展中扮演重要角色。例如，它是促进胃癌干性的关键因子，推动卵巢癌进展，并促进乳腺癌细胞迁移。研究也报道FOXP4反向控制肿瘤抑制基因并促进甲状腺癌进展，FOXP4在乳腺癌中的上调促进迁移和侵袭。此外，miR-491-5p通过调节非小细胞肺癌和骨肉瘤中的FOXP4表达来阻止癌症进展。因此，我们假设LINC00917可能通过调控miR-491-5p/FOXP4轴介导乳腺癌的骨转移。

基于上述背景，本研究旨在探讨LINC00917是否通过靶向调控miR-491-5p/FOXP4轴在乳腺癌骨转移中发挥重要作用。本研究将为乳腺癌骨转移提供重要线索。

Materials and Methods

患者与样本收集

使用G*Power 3.1进行样本量计算。设定α=0.05，检验效能=0.8，计算得出每组所需样本量为64例。本研究共招募了在昆明医科大学第三附属医院接受手术治疗的254名乳腺癌患者，并将其分为无骨转移组（NBM, n=129）和骨转移组（BM, n=125）。所有病例均经病理和组织学确诊为乳腺癌。所有骨转移患者均经影像学检查证实至少存在一处转移性病灶，并伴有骨转移所致疼痛。此外，本研究排除了初诊时已存在其他转移部位的晚期乳腺癌患者，以及患有其他器官原发性恶性肿瘤的患者。对所有患者进行了为期36个月的随访，并记录其死亡情况。

本研究已提交昆明医科大学第三附属医院伦理委员会审查并获正式批准（批准号：kmmu20200723）。所有参与研究的患者或其法定代表人均已签署知情同意书，明确表示知晓并同意研究内容。本研究遵循《赫尔辛基宣言》。

细胞培养与转染

本研究选择MCF-10A细胞和乳腺癌细胞MDA-MB-231 (HTB-26)、MCF-7 (HTB-22)、BT-549 (HTB-122)和MDA-MB-468 (HTB-132)（ATCC, USA）进行研究。MDA-MB-468属于三阴性乳腺癌（TNBC）亚型，MDA-MB-231是应用最广泛的TNBC细胞系之一，具有强转移能力，常用于骨转移研究。BT-549是一种侵袭性TNBC细胞，常用于研究乳腺癌的侵袭和转移机制。MCF-7是一种雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌细胞系，与TNBC细胞系形成亚型比较，以验证LINC00917在不同乳腺癌亚型中的表达或功能差异。在以往的研究中，这些细胞系被用作乳腺癌或骨转移研究的主体。BT-549使用补充了10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基培养。MDA-MB-468、MDA-MB-231和MCF-7细胞使用补充了10% FBS的DMEM培养基培养。此外，MC3T3-E1和RAW264.7细胞购自尚恩生物（中国武汉），维持在DMEM中，并于37°C、5% CO₂条件下培养。

LINC00917的小干扰RNA（si-LINC00917, G04009）、siRNA阴性对照（si-NC, A06001）、miR-491-5p模拟物（mimic, B02003）、miR-491-5p抑制剂（inhibitor, B03001）以及模拟物/抑制剂阴性对照（NC, B04002）均购自吉玛基因，其序列列于补充表1。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行细胞转染。

为探讨LINC00917对乳腺癌骨转移的影响，使用Transwell小室将RAW264.7或MC3T3-E1细胞与转染后的MDA-MB-231细胞在体外共培养，以建立骨转移模型。将MC3T3-E1细胞在含有10 mM β-甘油磷酸盐和25 mM抗坏血酸的培养基中培养7天以诱导成骨分化。此外，用含有M-CSF（50 ng/mL）和RANKL（50 ng/mL）的培养基处理RAW 264.7细胞7天以诱导破骨细胞分化。将MDA-MB-231细胞在无血清培养基中饥饿处理12小时。实验选用孔径为0.4 μm的六孔Transwell插入式培养皿。将RAW264.7（1×10⁴）或MC3T3-E1（1×10⁴）细胞接种于Transwell下室的每个孔中，并加入2 mL完全DMEM培养基。将1×10⁴个MDA-MB-231细胞接种于上室的每个孔中，并加入2 mL无血清DMEM培养基。将培养物在37°C、5% CO₂条件下培养48小时。

RT-qPCR分析

使用TRIzol试剂（Sigma Chemicals Co）提取总RNA。随后，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher）合成互补DNA（cDNA）。在7300 Sequence Detection System（Applied Biosystems/Roche）上使用SYBR Premix Ex Taq mix进行qRT-PCR。以GAPDH和U6作为内参。使用2^?ΔΔCt法计算相对表达水平。引物序列见补充表2。

双荧光素酶报告基因检测

使用Lipofectamine 2000将含有LINC00917或FOXP4野生型或突变型3'UTR的荧光素酶报告载体与miR-491-5p模拟物或模拟物NC，以及miR-491-5p抑制剂或抑制剂NC共转染细胞。转染24小时后，使用Luciferase Assay System（Promega）定量荧光素酶活性。

CCK-8检测

转染后，将细胞接种到96孔板中。在每个24小时时间点，依次向该特定时间点的测试孔中加入CCK-8试剂，并继续在37°C下孵育2小时。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度（OD）值。

Transwell实验

使用Transwell小室进行细胞迁移和侵袭实验。简要步骤如下：清洗后，将细胞重悬于无血清DMEM中制成单细胞悬液。随后，将细胞悬液加入Transwell插室顶部，孵育10分钟。下室加入含有FBS的DMEM培养基。孵育12小时后，取出小室，用棉签刮掉膜上未迁移的细胞。迁移的细胞用4°C的5%戊二醛固定，并用结晶紫染色30分钟。固定和染色后，在光学显微镜下（放大倍数200×）从每个迁移膜上随机选择五个不重叠的视野进行细胞计数。计数过程由两名实验人员采用双盲法独立完成，取平均值作为样本的迁移细胞数。

统计分析

使用SPSS和GraphPad Prism进行统计分析。两组间差异比较采用t检验。三组或以上组别比较采用方差分析（ANOVA）。使用Kaplan-Meier曲线进行生存分析。采用多因素Cox比例风险回归分析确定影响患者生存的风险因素。所有细胞实验均独立重复三次，每次重复实验包含三个生物学重复样本。统计学显著性设定为p值小于0.05。

Results

两组患者基本资料比较

两组患者在年龄、肿瘤大小、月经状态和分子分型方面无显著差异。然而，在血管癌栓和淋巴结转移方面观察到显著差异，具体而言，BM组中患有血管癌栓和淋巴结转移的患者数量显著更高（表1）。

LINC00917在乳腺癌患者和细胞中的表达

与NBM患者相比，骨转移患者中LINC00917的表达显著增强（图1A）。此外，LINC00917在乳腺癌细胞中的表达也上调，尤其是在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中显示出最显著的差异（图1B）。

LINC00917水平与乳腺癌骨转移患者预后的相关性

根据LINC00917的平均水平将骨转移患者分为两组。结果显示LINC00917与这些患者的淋巴结转移显著相关（表2）。此外，Kaplan-Meier曲线显示LINC00917高表达患者的生存率降低（图2A）。另外，淋巴结转移和LINC00917可能是影响骨转移的独立因素（图2B）。

miR-491-5p是LINC00917的潜在靶向miRNA

研究结果显示miR-491-5p在骨转移患者中表达降低（图3A），且与LINC00917呈负相关（图3B）。此外，实验结果表明与正常细胞相比，miR-491-5p在乳腺癌细胞中的表达显著降低（图3C）。LINC00917与miR-491-5p的结合位点如图3D所示。过表达miR-491-5p导致野生型LINC00917的荧光素酶活性降低，而抑制miR-491-5p则导致野生型LINC00917的荧光素酶活性增加。然而，模拟物或抑制剂对突变型LINC00917的荧光素酶活性均无显著影响（图3E和F）。

抑制LINC00917和miR-491-5p对乳腺癌细胞的影响

靶向LINC00917的siRNA有效降低了细胞系中LINC00917的表达（图4A）。此外，选择转染效率最高的siRNA用于后续实验。然而，抑制LINC00917显著提高了miR-491-5p的水平，而转染miR-491-5p抑制剂导致miR-491-5p水平显著降低（图4B）。另外，抑制LINC00917导致乳腺癌细胞增殖能力下降，这表明LINC00917可能在促进肿瘤细胞生长中起关键作用，而miR-491-5p抑制剂可以部分抵消这种效应（图4C和D）。进一步研究发现，LINC00917抑制降低了细胞的迁移和侵袭能力，表明LINC00917可能参与调节与转移相关的生物学过程。但下调miR-491-5p抵消了这些变化，从而增加了细胞的迁移和侵袭数量（图4E和F）。这些结果进一步支持了LINC00917通过调节miR-491-5p影响乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的假设。

LINC00917和miR-491-5p对成骨细胞和破骨细胞分化的影响

研究使用RAW264.7细胞作为破骨细胞分化的体外模型，以评估LINC00917对此过程的影响。将RAW264.7细胞与转染后的MDA-MB-231细胞共培养。数据显示，下调LINC00917导致破骨细胞生成转录因子（TRAP、NFATc1和Cathepsin K）的mRNA水平降低。相反，抑制miR-491-5p导致TRAP、NFATc1和Cathepsin K的mRNA表达增加（图5A）。

此外，研究进一步探讨了LINC00917和miR-491-5p对肿瘤微环境中成骨细胞分化的影响。实验结果表明，抑制LINC00917显著促进了MC3T3-E1和MDA-MB-231共培养系统中OPG mRNA的表达，同时抑制了RANKL mRNA的表达。此外，OPG/RANKL比值显著增加。然而，miR-491-5p抑制剂逆转了LINC00917抑制对成骨细胞中OPG和RANKL表达水平的调节作用（图5B）。

FOXP4可能是miR-491-5p的靶基因

在乳腺癌骨转移患者中，FOXP4表达显著升高（图6A）且与miR-491-5p水平呈负相关（图6B）。使用ENCORI数据库鉴定了FOXP4与miR-491-5p之间的潜在结合位点（图6C）。后续实验显示，在两种乳腺癌细胞系中，miR-491-5p模拟物抑制了野生型FOXP4载体的荧光素酶活性，而miR-491-5p抑制剂则显著增强了其活性（图6D–E）。此外，LINC00917抑制导致FOXP4表达降低，而miR-491-5p下调导致FOXP4表达增加（图6F）。

Discussion

研究发现lncRNA的异常表达可能是癌症骨转移的常见机制。例如，在具有强骨转移特性的MDA-MB-231-BO细胞中，TRG-AS1表达降低，可能抑制乳腺癌骨转移。破骨细胞前体和成熟破骨细胞中MALAT1表达降低与骨质疏松和转移性骨病变有关。LINC00263过表达显著促进乳腺癌骨转移。本研究证明LINC00917通过竞争性结合miR-491-5p作为ceRNA发挥作用，导致FOXP4表达上调，从而促进乳腺癌骨转移。

本研究发现LINC00917在乳腺癌骨转移患者中异常高表达。进一步分析显示，LINC00917水平与患者的淋巴结转移状态显著相关，且LINC00917高表达患者预后较差，生存时间较短。这一现象进一步验证了LINC00917作为乳腺癌不良预后生物标志物的潜在价值。统计分析表明，LINC00917高表达是患者不良预后的独立危险因素，这意味着即使在排除其他已知危险因素的影响后，LINC00917的表达水平仍能显著预测患者的生存状况。这一观察结果与先前研究的发现一致，提示LINC00917可能是乳腺癌预后的风险因素。这些发现揭示了LINC00917与乳腺癌骨转移的联系，为未来的研究提供了方向，并为其潜在的临床应用奠定了基础。

为探讨LINC00917影响乳腺癌骨转移的分子机制，研究进行了体外实验。还观察到LINC00917在乳腺癌细胞中异常过表达。lncRNA的异常已被证实具有抑癌或致癌作用，并在肿瘤发展中扮演重要角色。在MCF-10A细胞中，LINC00917可能在维持正常细胞内稳态中发挥作用，因为非癌细胞中的lncRNA通常调节基本的细胞过程。相比之下，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，LINC00917呈现上调趋势，并与促转移功能相关。此外，研究预测了受LINC00917调控的下游miRNA，发现LINC00917作为miR-491-5p的ceRNA，影响乳腺癌的细胞功能。敲低LINC00917抑制了细胞增殖、侵袭和迁移。然而，miR-491-5p抑制剂抵消了这种效应。这进一步表明LINC00917可能通过调节miR-491-5p的表达来促进乳腺癌进程。

骨转移的发展与多种因素相关，涉及癌细胞、骨基质、破骨细胞和成骨细胞之间复杂的相互作用。具体而言，乳腺癌细胞分泌细胞因子和生长因子刺激骨吸收，从而加速破骨细胞发育并导致溶骨性转移。我们的研究表明，在体外模型中敲低LINC00917抑制了调节破骨细胞生成的转录因子的表达。这一发现表明抑制LINC00917可能对乳腺癌骨转移的病理进展提供保护作用。此外，成骨细胞可以表达RANKL与破骨细胞前体细胞上的RANK受体结合，促进其分化为成熟破骨细胞。相反，成骨细胞可以分泌OPG抑制RANK/RANKL通路。我们进一步观察到抑制LINC00917增强了OPG表达，同时抑制了RANKL表达，从而调节了OPG/RANKL平衡。这可能表明抑制LINC00917有助于增强成骨细胞的功能。

先前的研究表明，FOXP4上调可能抵消miR-491-5p的肿瘤抑制效应。与这些发现一致，我们的研究显示FOXP4表达在乳腺癌骨转移中上调，并证实FOXP4是miR-491-5p的靶基因。LINC00917通过吸附miR-491-5p作为ceRNA，从而上调FOXP4表达。这些结果表明，在乳腺癌骨转移过程中FOXP4的上调可能会干扰miR-491-5p的功能，从而解除其对癌细胞生长的抑制作用。有报道称FOXP4在乳腺癌中的上调促进细胞迁移和侵袭。此外，FOXP4促进前列腺癌的细胞增殖和转移。因此，FOXP4的上调可能干扰miR-491-5p对乳腺癌细胞转移的抑制作用，从而促进肿瘤细胞的恶性行为。基于这些观察，我们提出LINC00917可能通过调控miR-491-5p/FOXP4轴影响乳腺癌骨转移的发展。

近年来，大量研究揭示了lncRNA在骨转移过程中的关键作用。LINC00263通过诱导破骨细胞生成并抑制其铁死亡过程，显著促进乳腺癌相关的溶骨性骨转移。MALAT1可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，这可能影响骨骼的重塑和修复过程。LncRNA TEX41通过上调转录因子RUNX2的表达水平参与调节自噬过程，从而影响肿瘤细胞在骨组织中的定植和生长。这些研究从不同角度揭示了各种分子在骨转移过程中的调控机制。因此，LINC00917影响乳腺癌骨转移的机制需要更多实验来研究。

研究发现，术后三年，ER+肿瘤的总体远处复发风险显著高于ER-肿瘤，并且ER状态是晚期骨转移复发的重要预后风险因素。在本研究中，敲低LINC00917显著抑制了ER+（MCF-7）和三阴性乳腺癌（MDA-MB-231）细胞的迁移和侵袭能力。尽管在MDA-MB-231细胞中抑制程度更大（迁移：43% vs 47%；侵袭：41% vs 42%），但两种细胞系之间的差异很小。这可能表明LINC00917在ER+和TNBC中均起关键作用，提示其调控机制可能独立于ER信号通路。此外，这可能是因为体外迁移/侵袭实验可能无法完全模拟体内微环境。在未来的研究中，可能需要更多的体内实验来探索ER状态与LINC00917在骨转移中的关联。另外，我们分析了LINC00917表达水平与乳腺癌患者不同分型之间的关系，发现骨转移患者中LINC00917的表达与患者的分子分型无显著相关性。这可能是由于本研究纳入的患者数量不足。

本研究的一个显著局限性是未专门研究ER状态与LINC00917在骨转移中的关系。因此，在未来的实验中，应纳入更多患者并进行分类，以系统性地探索LINC00917、ER状态与乳腺癌骨转移之间的关联。此外，也需要体内实验来研究ER状态与骨转移的关系。另外，LINC00917可能参与其他信号通路的调控，其确切机制仍有待充分阐明。需要进一步的实验和深入调查来解开其全面的功能网络。此外，FOXP4在细胞功能中的具体作用有待进一步验证。未来的研究应结合体内和体外实验，以进一步证实本研究的结论。

Conclusion

LINC00917在乳腺癌骨转移中表达上调，且与不良预后相关。此外，敲低LINC00917抑制了乳腺癌细胞的功能，抑制了破骨细胞生成，同时促进了成骨细胞分化。而且，miR-491-5p抑制剂抵消了LINC00917对细胞模型的影响。此外，FOXP4可能是miR-491-5p的靶基因。因此，LINC00917/miR-491-5p/FOXP4轴可能参与了乳腺癌的发病机制。

Disclosure

作者声明在本工作中无利益冲突。