双翅目昆虫bicoid基因起源前推2000万年：非环裂类蝇类功能发现与系统发育重建揭示前轴决定网络的动态演化

《Current Biology》：Revised evolutionary relationships within Brachycera and the early origin of bicoid in flies

本研究通过分析186种双翅目昆虫基因组，在非环裂类蝇类（蜂虻科、剑虻科）中发现了功能性的bicoid（bcd）基因，将其起源时间前推约2000万年。研究重新构建了双翅目系统发育骨架，揭示bcd基因在异趾类（Heterodactyla）共同祖先中起源并经历了至少16次独立丢失，表明昆虫前-后轴（AP）决定网络具有高度动态性。该发现为理解发育基因的演化及形态多样性提供了新视角。

　　

Revised evolutionary relationships within Brachycera and the early origin of bicoid in flies

引言：昆虫发育过程中前-后轴的特化

昆虫身体图式，包括头部和尾部区域，在胚胎发生早期就被特化。这一过程由转录因子网络决定，其激活级联反应导致时空表达，随后是特定于胚胎某些区域的细胞分化。调控这一过程的精确基因在昆虫之间甚至近缘物种之间差异很大。在双翅目（Diptera）中，建立胚胎头尾极性的前决定因子（AD）基因在整个目中有所不同。在果蝇（Drosophila melanogaster）中，前-后（AP）极性由bicoid（bcd）基因启动，该基因在发育生物学中作为形态发生素被广泛研究，在进化生物学中则揭示了转录因子基因调控网络的演化。在非环裂类蝇类中，这一过程由其他非同源转录因子控制，例如库蚊（culicine mosquitoes）中的cucoid、摇蚊（midges）中的panish、大蚊（craneflies）中的pangolin以及蛾蚋（moth flies）中的odd-paired。尽管在决定AP极性的转录因子采用方面存在明显的灵活性，但在蝇类系统发育中仍存在大片区域，这些AD基因的存在或缺失尚未被描述。

bcd基因是环裂部（Cyclorrhapha）内主要的前决定因子（AD）基因，环裂部是一个庞大而多样化的蝇类支系，黑腹果蝇即属于此类。该基因在抚育细胞（nurse cells）中母系表达，抚育细胞将RNA沉积到卵母细胞中；bcd RNA通过微管主动运输和尚未完全理解的锚定过程，被定位在蝇卵的前部。翻译后，Bicoid蛋白沿着前-后轴形成梯度，调控一系列靶基因的转录。缺乏bcd的胚胎会导致头部和胸部结构发育失败，产生双腹部表型。bcd基因起源于蝇类中Hox3（在昆虫中称为zerknüllt或zen）旁系同源基因的串联基因重复事件；zen参与胚胎外组织（在低等环裂类蝇类中是浆膜和退化的羊膜，在裂部蝇类中是羊浆膜）的发育，这一功能被认为是有翅昆虫的祖征。祖先bcd基因可能通过其3'非翻译序列的改变、母系表达和向卵前部的定位而获得新的发育功能。此外，Bicoid在同源异型域（HD）内获得了关键的氨基酸替换，影响了DNA结合活性并建立了RNA结合能力。这些变化赋予了对指定前后结构的转录因子的调控控制，特别是抑制了涉及确定后部的转录因子Caudal的RNA翻译。或者，zen基因可能除了胚胎外功能外，还演化出了AD功能，而bcd在基因重复后通过亚功能化接管了这一角色；在这种情况下，Bicoid蛋白中的氨基酸替换可能与下游靶序列的变化共同进化。

功能测定揭示了Bicoid HD内允许其在新功能下进行模式化活动的关键替换。祖先序列重建发现祖先Zen HD（AncZB HD）和祖先Bicoid HD（AncBcd HD）之间存在31个氨基酸差异，其中11个是“诊断性的”，存在于9个现生Bicoid HD序列中，而在20个Zen HD序列中缺失。这些祖先HD已通过体内拯救实验进行测试，以评估哪些变化或变化组合导致了新特性。HD识别螺旋中的两个关键氨基酸变化，即第50位谷氨酰胺到赖氨酸的替换（Q50K）和第54位甲硫氨酸到精氨酸的替换（M54R），当组合在一起时，被发现对恢复Bicoid的模式化活性有很大影响，能够激活五个靶基因。后来的工作发现了Bicoid完整模式化活性演化的复杂逐步路径，这需要HD三个子域中替换的组合以确保稳健的活性，并且在基因早期演化期间可能存在次优的中间Bicoid HD序列。

结果

双翅目昆虫zen和bicoid的演化

我们在186种双翅目物种的基因组中注释了所有Hox基因，这些物种由染色体级别的组装代表，从而有助于准确识别和分类Hox基因簇中的所有基因。我们关注Hox3基因座（zen）及其旁系同源基因（包括bcd），在物种树上绘制了增益、丢失和拷贝数变异的模式。我们发现zen的拷贝数在双翅目系统发育中存在极大变异，与先前在鳞翅目（Lepidoptera）中发现的重复率相似，从大蚊科（Tipulidae）的单个zen基因到寄蝇科（Tachinidae）的Tachina fera中的118个zen基因座。我们注意到，这里注释的Hox3基因座补体可能包括功能基因、包含外显子重复的基因和假基因。与先前的研究相反，我们发现了bcd在非环裂类支系中存在的证据，包括蜂虻科（Bombyliidae）的所有四个物种（Anthrax anthrax, Villa cingulata, Bombylius major, Bombylius discolor）和剑虻科（Therevidae）的两个物种（Thereva unica, Thereva nobilitata）。来自这些物种的推定bcd序列在基因树中与环裂类bcd序列形成一个支系，排除了所有其他zen序列。在基因树中，所有bcd序列与剩余zen序列之间存在一个明显的长分支，表明在导致bcd的重复之后序列发生了高速率的变化。有趣的是，将非环裂类bcd序列与剩余环裂类分支分开的分支长度，虽然不如通向bcd支系的分支长，但表明在环裂部出现的同时，Bicoid HD中发生了进一步的替换积累。

来自非环裂类bcd注释的进一步支持是通过检查60个氨基酸的HD区域与其他特征明确的bcd序列（例如来自果蝇的序列）的比对获得的。我们将这些序列注释为非环裂类支系中的bcd，它们共享关键的氨基酸替换，即Q50K和M54R，这些是Bicoid独有的，并且已在体内被证明对果蝇前部决定作用至关重要。最后，我们还发现非环裂类物种中的bcd基因具有完整的、不间断的开放阅读框。我们还绘制了来自雄性Bombylius major和雌性Bombylius discolor腹部的公开RNA测序数据，发现仅在B. discolor样本中存在bcd表达，正如我们所期望的，因为bcd在雌性腹部（卵子发育的地方）母系表达。综上所述，这是强有力的证据，表明bcd存在于环裂部之外的蝇类中，这意味着该基因通过重复事件出现的时间比先前认为的早约1000-5000万年。

Bombylius major胚胎中bicoid mRNA前部定位的证据

为了确定非环裂类bcd基因是否具有母系表达和前部RNA定位，我们对从雌性Bombylius major蝇解剖的卵巢进行了整体原位杂交。在未受精的B. major卵母细胞中检测到母系bcd RNA，紧密定位在前部条纹中。这种RNA定位模式与黑腹果蝇非常相似，在果蝇中，RNA从抚育细胞运输出来，并被锚定在卵母细胞的前部。Bombylius和Drosophila相似的RNA前部定位意味着我们基于氨基酸序列特征、分子系统发育和染色体位置的bcd鉴定可能也反映了功能上的相似性。我们推断Bicoid作为双翅目AD的演化时间比先前报道的要早得多，即在蜂虻科和环裂部分化之前。

重新审视双翅目系统发育中的深部分支模式

为了重建bcd在双翅目系统发育史上的出现和丢失历史，我们首先必须解决短角亚目（Brachycera）系统发育中存在的显著不确定性。双翅目物种树经历了重大变化，对支系的支持度各不相同，特别是在非环裂类短角亚目支系内部。这些短角亚目支系由24个已描述的科组成，包括诸如水虻科（Stratiomyidae）、食虫虻科（Asilidae）和蜂虻科（Bombyliidae）等类群。由于缺乏跨这些科的高质量基因组数据，解决这一问题一直很困难，大多数研究依赖于跨大量分类群采样的少量基因来解决这一系统发育问题。这与短角亚目早期演化中约2亿年前的快速多样化相混淆，认为这与开花植物的演化同时发生。先前的研究将几乎所有的非环裂类短角亚目科归入一个单系群，称为直裂群（Orthorrhapha），尽管来自形态学和分子分析的支持始终有限。对于舞虻总科（Empidoidea）（包括舞虻）与环裂部（称为Eremoneura）的分组存在强有力的支持。对于剩余的非环裂类支系，先前的研究发现对三个下目水虻总科（Stratiomyomorpha）（水虻科和木虻科）、木虻总科（Xylophagomorpha）（木虻科）和虻总科（Tabanomorpha）（包括虻科和鹬虻科）的分组（称为SXT支系）支持较弱，并且蜂虻科的放置存在冲突，要么是剩余食虫虻总科（Asiloidea）科的姐妹群，要么是食虫虻总科和Eremoneura的姐妹群。

在这里，我们使用覆盖了树这部分大多数科的分类群采样和大量基因，重新审视了非环裂类短角亚目蝇的分支模式。我们的数据集包括代表早期分支的短角亚目科的物种：鹬虻科（Athericidae）（1种）、虻科（Tabanidae）（1种）、小头虻科（Acroceridae）（1种）、木虻科（Xylophagidae）（1种）、水虻科（Stratiomyidae）（9种）、蜂虻科（Bombyliidae）（4种）、剑虻科（Therevidae）（2种）、食虫虻科（Asilidae）（10种）、舞虻科（Empididae）（3种）、长足虻科（Hybotidae）（1种）和蜢虻科（Dolichopodidae）（3种），以及17个外群物种（代表8个科）和133个来自环裂部的物种（代表24个科）。重要的是，这些物种由染色体级别的组装代表，允许提取大量单拷贝直系同源（SCO）基因来解决这一系统发育问题。

使用针对双翅目的BUSCO（v5.6.1）基因集（diptera_odb10），我们确定了在我们数据集中所有186个物种中都存在的412个SCO（dat100），以及存在于至少90%物种中的2,998个SCO（dat90）。另外，从所有物种中都存在的412个SCO中构建了一个子集数据集，通过基于七个比对和基因树