早红糯代谢组学分析：揭示其祛湿保健功能物质的作用机制

《Cogent Food & Agriculture》：Metabolomics analysis of health-care functional substances in Zaohongnuo

本研究通过非靶向代谢组学技术分析早红糯与普通红糯稻的代谢物差异，发现早红糯富含水飞蓟宾、七叶苷等具有祛湿保健功能的黄酮苷类和碳水化合物代谢物，其差异代谢物显著富集于半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等KEGG通路，为阐明早红糯祛湿保健作用的物质基础及产业化开发提供了理论依据。

　　

引言

种质资源是育种工作的物质基础，水稻育种突破离不开新种质资源的挖掘利用。广东省作为中国传统水稻主产区，拥有丰富的水稻种质资源，其中特种稻种质资源是重要的育种材料来源。普通稻指日常普遍种植和食用的水稻，籽粒以白色为主，口感相对中性；而特种稻则是相对于普通稻具有特定遗传性状和特殊用途的水稻品种，主要包括香稻、色稻和特种稻三大类。特种稻通常比普通稻含有更丰富的蛋白质、氨基酸、植物脂肪、矿物元素和维生素等营养成分，以及膳食纤维、不饱和脂肪酸、黄酮类等生理活性物质，具有特殊口感和保健功效。

早红糯是广东省东莞市的一种地方农家糯稻，属于民间特种稻资源，具有高营养价值和保健功效。东莞地区气候湿热，高温高湿天气易使人体积聚过多水分，进而导致内环境失衡，出现中医所描述的"湿气重"症状。当地民间习惯用早红糯的米粒或茎秆煮水饮用，以达到祛除湿气、促进机体新陈代谢和维持身体健康的目的。研究表明，早红糯富含酚类和黄酮类等药用成分，其中黄酮类物质具有显著的祛湿功效，而酚类化合物对祛湿也有直接或间接的辅助作用。作为特种稻，早红糯的必需氨基酸含量显著高于普通稻，其中异亮氨酸含量接近普通稻的两倍。

然而作为地方稻种，早红糯长期以来未得到足够科研重视，因其农家品种特性未得到改良，米质不如成熟的商品稻。加之以往生物技术手段的限制，对早红糯功能成分的探索仅限于少数物质。功能成分研究的缺乏制约了早红糯的产业化推广，不利于其资源的保护利用。目前，早红糯已逐渐受到政府和社会各界重视，2025年"早红糯种植技艺"被列为东莞市非物质文化遗产。

材料与方法

试验材料与粒型拍照

试验材料包括东莞市农业科学研究中心提供的东莞地方糯稻品种早红糯，以及华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心提供的红糯稻杭红糯1号。将早红糯和杭红糯1号的稻谷用于实验，部分稻谷用砻谷机脱壳得到糙米。早红糯和杭红糯1号的稻谷分别编号为ZHN和RN，糙米编号为BZHN和BRN。使用扫描仪获取早红糯和杭红糯1号的稻谷和糙米粒型照片。

代谢组学检测材料制备

准备早红糯和杭红糯1号的稻谷（组号ZHN和RN）和糙米（组号BZHN和BRN）各3份，每份2克。样品交由上海中科新生生物科技有限公司进行高分辨率非靶向代谢组学分析。主要仪器包括AB Triple TOF 6600质谱仪、Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪等。样品提取方法：样品在4°C缓慢解冻后，加入预冷的甲醇/乙腈/水溶液，涡旋混匀，低温超声30分钟，-20°C静置10分钟，4°C 14000 g离心20分钟，取上清液真空干燥，加入100 μL乙腈水溶液进行质谱分析。

色谱条件：使用ACQUITY UPLC BEH C-18色谱柱分离样品；柱温40°C；流速0.4 mL/min；进样量2 μL；流动相A：水+25 mM乙酸铵+0.5%甲酸，B：甲醇。质谱条件：使用AB Triple TOF 6600质谱仪采集样品的一级和二级质谱图，ESI源参数设置：Gas1: 60，Gas2: 60，CUR: 30，源温度：600°C，ISVF ±5500 V；TOF MS扫描范围m/z 60-1000 Da。

代谢组数据处理分析与图像绘制

数据预处理：将Wiff格式的原始数据通过ProteoWizard转换为.mzXML格式，使用MS-DIAL软件进行峰对齐、保留时间校正和峰面积提取。根据2017年澳大利亚布里斯班代谢组学协会年会建立的代谢物鉴定可靠性五级标准，成功匹配的代谢物在1级和2级鉴定，可分类至"超类"、"类"和"亚类"水平。

数据分析与图像绘制：分别对RN（对照组）与ZHN、BRN（对照组）与BZHN进行数据分析。总代谢物分析：使用MetaboAnalyst 6.0的Statistical Analysis功能绘制主成分分析图和代谢物相对含量热图，使用R语言corrplot包进行样品相关性分析和绘图。差异代谢物分析：以OPLS-DA VIP值>1、组间比较|log₂FC|>1且p值<0.05为阈值确定差异代谢物，使用R语言相关包进行K-means计算、层次聚类分析，结合KEGG数据库对差异代谢物进行注释，获得差异代谢物的KEGG富集分析结果。

结果

粒型比较

早红糯与杭红糯1号的稻谷和糙米外观比较显示，两个品种的稻谷壳颜色相似，均为浅褐黄色，而早红糯的稻谷壳颜色由浅褐色变为深褐红色。早红糯的糙米呈浅黄色，而杭红糯1号的糙米呈胡萝卜色。早红糯的稻谷和糙米的十粒长和十粒宽均大于杭红糯1号。

早红糯稻谷和糙米代谢物的鉴定与分析

为深入分析早红糯与杭红糯1号代谢物组成的差异，探索早红糯的特有代谢物，分别对两个品种的稻谷和糙米代谢组数据进行分析。主成分分析结果显示，两组样品明显分为两个亚组，各组样品的三个生物学重复集中分布。稻谷代谢组PCA分析的PC1和PC2值分别为50.2%和21.6%，糙米分别为45.2%和21.1%，表明样品组内重复性好。

样品相关性分析结果显示，样品间相关性高且为正相关，同组重复间相关性不低于0.90，样品重复性强。早红糯与杭红糯1号呈正相关，表明两个品种作为糯稻，大多数代谢物的种类和含量相对相似。

基于UHPLC/Q-TOF色谱-质谱分析技术和KEGG数据库，鉴定两组样品的代谢物，共鉴定出1563种代谢物。根据化学结构信息，1563个代谢物中共有1178个被成功分类。所有鉴定出的代谢物包括73个大类和207个小类，其中黄酮苷类（97个代谢物）、脂肪酸及其结合物（77个）、氨基酸/肽及其类似物（69个）、碳水化合物/碳水化合物结合物（59个）、二萜类（58个）等含量丰富。

早红糯稻谷和糙米差异代谢物的鉴定与分析

基于总代谢物的鉴定，筛选两组样品的差异代谢物。以"代谢物OPLS-DA VIP值>1、品种间比较|log₂FC|>1且p值<0.05"为阈值确定差异代谢物。比较ZHN和RN获得63个差异代谢物，比较BZHN和BRN获得56个差异代谢物。基于差异代谢物表达的K-means和聚类分析均显示，稻谷和糙米组间的差异代谢物可分为三大类。

基于差异代谢物含量的聚类分析将差异代谢物分为两组。组内差异代谢物含量的相关性良好，表明同一组内代谢物含量具有相似的分布模式。两组间差异代谢物含量的相关性较差，表明组间差异大，区分度好。

ZHN与RN组间存在63个差异代谢物，其中包含14个黄酮或黄酮苷类、4个碳水化合物或其结合物、4个二萜或萜内酯类等。与RN相比，ZHN中41个代谢物含量显著升高，22个代谢物含量显著降低。上调代谢物包括10个黄酮苷类、3个碳水化合物及其结合物等；下调代谢物包括双黄酮/聚黄酮类、二萜类和黄酮苷类各2个。BZHN与BRN组间鉴定出56个差异代谢物，包含15个黄酮或黄酮苷类、4个碳水化合物或其结合物等。与BRN相比，BZHN中28个代谢物含量显著升高，28个代谢物含量显著降低。上调代谢物包括碳水化合物及其结合物、脂肪酸及其结合物和甘油磷脂胆碱各3个等；下调代谢物主要为10个黄酮苷类，还包括3个双黄酮/聚黄酮类等。

在差异代谢物含量热图中，组内三个生物学重复的重复性好。ZHN与RN组间的差异代谢物中，代谢物数量较多的类别为黄酮苷类（12种，19.0%）和碳水化合物/碳水化合物结合物（4种，6.3%）。上调倍数较大的代谢物包括：吡蚜酮、水飞蓟宾、七叶苷、花旗松素-3-葡萄糖苷、三苯基氧化膦和异鼠李素-3-半乳糖苷。下调倍数较大的代谢物包括：3,4-二羟基苯甲醛、松香酸、甲基丁香酚、寇特林A、原花青素C1和原花青素B2。BZHN与BRN组间的差异代谢物中，代谢物数量最多的同样为黄酮苷类（12种，21.4%）和碳水化合物/碳水化合物结合物（4种，7.1%）。上调倍数较大的代谢物包括奥沙林、胆甾烯酮和羽扇豆酮。下调倍数较大的代谢物包括N-苯乙酰天冬氨酸、原花青素B1、盐酸青藤碱、原花青素C1和原花青素B2。

在ZHN与RN相比上调倍数较大的差异代谢物中，有7个具有较强祛湿药用价值的代谢物（水飞蓟宾、七叶苷、花旗松素-3-葡萄糖苷、异鼠李素-3-半乳糖苷、奥沙林、胆甾烯酮、羽扇豆酮）。早红糯稻谷和糙米中的原花青素（原花青素B1、B2和C1）含量显著低于杭红糯1号，这与早红糯糙米颜色明显浅于杭红糯1号的表型一致。

ZHN与RN组间以及BZHN与BRN组间共同存在21个差异表达代谢物。早红糯中含量高于杭红糯1号的代谢物包括羽扇豆酮、西伯利亚糖A₆、去甲氧基蓟黄素7-O-芸香糖苷、橙黄决明素β-D-葡萄糖苷，其中西伯利亚糖A₆被认为是通过促进脑神经健康来祛湿的代谢物。

差异代谢物的功能富集分析

为进一步探索差异代谢物涉及的代谢途径，对差异代谢物进行KEGG富集分析。以p值<0.05为阈值，共筛选出三个差异代谢物显著富集的通路，分别是"半乳糖代谢"、"新霉素、卡那霉素和庆大霉素生物合成"以及"淀粉和蔗糖代谢"。ZHN_vs_RN中差异代谢物富集于"半乳糖代谢"，该通路富集的代谢物包括棉子糖、D-葡萄糖和D-山梨醇。"新霉素、卡那霉素和庆大霉素生物合成"以及"淀粉和蔗糖代谢"通路均富集于D-葡萄糖。BZHN_vs_BRN中差异代谢物富集于"半乳糖代谢"，该通路富集的代谢物包括棉子糖和α-乳糖。

这些结果表明，早红糯与杭红糯1号在碳水化合物代谢物组成上存在差异。早红糯中棉子糖、D-葡萄糖和α-乳糖含量高于杭红糯1号，这与其甜味特征一致。表明两个糯稻在半乳糖、淀粉、蔗糖和抗生素合成代谢通路上存在差异，代谢物及其通路的差异与糯稻的营养品质密切相关。

讨论

使用具有保健功能的特种稻进行"食疗"是广东人的日常饮食习惯。早红糯作为具有祛湿保健功能的广东特色农家功能稻，具有产业化应用推广前景。但由于其营养品质和保健原理不明确，限制了早红糯的产业化进程。为探索早红糯特有的功能物质，本研究以普通红糯稻杭红糯1号作为对照，基于色谱-质谱分析技术鉴定早红糯的营养品质，分析差异代谢物，探索代谢通路差异，为早红糯种质资源的科学利用奠定理论基础。

研究发现，早红糯与普通红糯稻杭红糯1号在粒型上存在明显差异，早红糯糙米颜色浅于杭红糯1号，表明色素代谢物可能不是早红糯发挥保健作用的主要代谢物。主成分分析结果表明两个品种明显区分，组内重复样品间相关性高，数据可靠性强。在糙米中，早红糯的色氨酸（必需氨基酸）含量约为杭红糯1号的3倍，这与之前研究的早红糯必需氨基酸异亮氨酸含量是普通稻两倍的结果相似，表明早红糯在补充必需氨基酸方面具有独特功效。

湿证是中医常见内科疾病的主要证型，临床症状包括烦躁、疲劳、腹胀、食欲不振、胸闷、尿短、口干口苦等，与各种脾、胃、肝、胆炎症及其引发的癌症密切相关。两个比较组ZHN_vs_RN和BZHN_vs_BRN的差异代谢物具有祛湿、保健和药用价值。例如，水飞蓟宾是目前对肝病最有效的黄酮类化合物，能稳定肝细胞膜，维持肝细胞完整性，加速肝细胞DNA合成，预防肝癌。七叶苷具有抗炎、抗菌、抗凝血和镇痛活性，对小鼠有明显的利尿作用。花旗松素-3-葡萄糖苷是紫杉醇的衍生物，是一种高效、低毒、广谱的天然抗癌药物，广泛用于治疗乳腺癌、卵巢癌以及一些头颈癌和肺癌。异鼠李素-3-半乳糖苷是异鼠李素的衍生物，是一种具有抗氧化、心血管保护、抗炎、抗癌和神经保护作用的药用活性成分。奥沙林是梅洛霉素的O-甲基化衍生物，是一种具有体外抗癌活性的真菌分离物。胆甾烯酮是胆固醇的中间氧化产物，主要在肝脏代谢，可抵抗幽门螺杆菌感染，缓解肥胖引起的小鼠代谢紊乱。羽扇豆酮是植物性食品中的重要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗糖尿病和抗癌等多种药理活性。西伯利亚糖A₆可安神助眠，缓解湿证对睡眠的负面影响。

两个比较组的差异代谢物富集于"半乳糖代谢"、"新霉素、卡那霉素和庆大霉素生物合成"和"淀粉和蔗糖代谢"。富集在"半乳糖代谢"中的代谢物棉子糖具有抗炎和增强免疫等保健作用，可调节肠道菌群，具有抗炎、抗氧化和免疫调节活性。D-葡萄糖作为ZHN_vs_RN三个代谢通路中的核心物质，是一般代谢的关键组成部分，也是与细胞代谢状态及生物和非生物胁迫反应相关的关键信号分子。

结论

综上所述，与普通红糯稻相比，早红糯具有丰富的祛湿保健功能代谢物种类且含量较高，对湿证表现的肝火炎症、尿短、胸闷烦躁等临床症状具有积极的保健作用。此外，其含有丰富的人体营养物质如色氨酸和棉子糖，具有较强的祛湿保健功效。