蔬菜型木豆（Cajanus cajan (L.)）基因型的营养品质与产量相关性状评估及分子表征研究

《Cogent Food & Agriculture》：Evaluation and molecular characterization of vegetable type pigeonpea (Cajanus cajan (L.)) genotypes for nutritional quality and yield attributing traits

本文系统评估了16个蔬菜型木豆基因型在青荚期的农艺性状、营养品质及基于起始密码子靶向（SCoT）标记的遗传多样性。研究发现基因型间在叶绿素含量、叶面积、株高及产量构成上存在显著变异，青荚单株产量具有最高基因型变异系数（GCV=30.11%）。SCoT标记（PIC值0.4145–0.8397）有效区分基因型，营养分析表明蔬菜型木豆锌、铁含量更高，而籽粒型蛋白质和钙更丰富。基因型与发育阶段（R6/R8）互作显著影响营养积累，为木豆育种中遗传背景与发育阶段协同考量提供了重要依据。

　　

摘要

木豆（Cajanus cajan）作为一种重要豆类作物，因其高蛋白含量和多样化用途而备受重视。本研究利用起始密码子靶向（SCoT）标记，对16个蔬菜型木豆基因型在青荚期的农艺性状、营养品质及遗传多样性进行了系统评估。结果表明，基因型在叶绿素含量、叶面积、株高及产量构成性状上存在显著变异。青荚单株产量表现出最高的基因型变异系数（GCV），而R₈期叶绿素含量变异最小。100鲜荚重的广义遗传力最高，R₆期叶绿素含量最低。热图分析揭示了性状的明显聚类，荚重、荚长与产量间存在强正相关。SCoT标记能有效区分基因型，多态性信息含量（PIC）值范围为0.4145至0.8397，其中SCoT-13的PIC值最高。营养分析显示蔬菜型木豆锌、铁含量较高，而籽粒型蛋白质和钙更丰富。互作分析表明基因型与发育阶段存在显著互作效应，钙、碳水化合物和蛋白质从青荚期到成熟籽粒期逐渐增加，而铁、锰和锌含量因基因型而异。这些发现强调了在育种中考虑遗传背景和发育阶段的重要性，建议对产量和营养性状采用平行育种策略。

引言

木豆是鹰嘴豆之后的重要作物，因其强大的直根系统和天生的抗旱性而在旱地农业中占据重要地位。其单位面积产生大量生物量的能力使其对农村社区具有重要价值，可用作饲料和覆盖材料。此外，它还提供薪柴和谷物，支持尼日利亚的自给农业。大量的落叶丰富了土壤有机质，而其深厚广泛的根系在分解后有助于土壤通气，深受农民重视。其对各种土壤和多样化农业生物条件的适应性增加了其吸引力。木豆富含蛋白质，其种子可加工成各种餐食，作为豇豆和花园豌豆的替代品。重组育种的成功取决于亲本植物的多样性以实现后代进步。

蔬菜型木豆代表了这种多功能作物的一种专门栽培品种，专门满足烹饪用途，在农业领域正获得关注和认可。与为种子种植的传统木豆不同，蔬菜型侧重于嫩荚和种子，使其成为全球多样化菜肴的宝贵补充。凭借其对不同气候的适应性及其高产量潜力，蔬菜型木豆提供了一系列风味和质地，吸引厨师和家庭厨师。其在菜肴中的多功能性，从炒菜到汤、沙拉和咖喱，突出了其作为抢手蔬菜的重要性，为烹饪创作贡献了味道和营养益处。由于所有这些原因，蔬菜型木豆代表了豆类作物家族中的一个新兴方面，为种植者和消费者提供了多功能性和营养益处。

任何旨在改良数量性状的育种计划的有效性取决于存在的遗传变异程度。因此，植物育种计划的成功在很大程度上取决于与所需性状相关的遗传多样性的可用性，以及植物育种家在选择技术方面的熟练程度。变异性、遗传多样性、预期遗传进展和性状遗传力等因素是通过遗传手段增强性状的基础。基因型和表型变异系数、遗传力和遗传进展等参数是育种计划中有效选择的可靠指标。了解产量及其贡献性状之间的相关性有助于育种者确定对产量贡献最大的具体特征，从而促进实质性的遗传改良。将农艺评估与分子表征相结合，提供了基因组水平上存在的变异性的全面理解。因此，本研究旨在分析作物内的分子表征和遗传分歧，探索表型和基因型变异性，同时评估广义遗传力和遗传进展。这些数据对育种者具有巨大价值，指导他们选择最佳亲本和育种材料，以开发适合雨养条件的高产木豆品种。

材料与方法

试验种植材料

从不同来源收集了16个不同种子颜色的木豆基因型（图1），基于它们作为蔬菜作物的用途（表S1）。本试验在印度马哈拉施特拉邦阿科拉Dr. P.D.K.V.的农业植物学试验农场进行。田间试验采用随机完全区组设计（RCBD），三次重复。行距和株距保持在90 × 20厘米。在雨季期间，采用条播法播种。肥料包括25公斤氮、50公斤五氧化二磷和30公斤氧化钾每公顷，在播种时以尿素、过磷酸钙和氯化钾的形式施用。随后，在植株进入开花期时，根据具体需求提供2-3次灌溉。根据各自基因型的成熟度进行收获。

数据收集

农艺性状

从每个重复中随机选择五株植株，在籽粒/蔬菜期（R₆）和成熟期（R₈）观察各种性状。产量相关特征包括50%开花天数、R₆期首次蔬菜采收天数、R₆期株高（厘米）、单株一级分枝数、100鲜荚重（克）、100鲜种子重（克）、荚长（厘米）、荚宽（厘米）、每荚种子数和单株青荚产量（所有采摘次数的总和）（克）。此外，在50%开花期使用SPAD-502在选定的五株植株的三片叶子上测定叶绿素含量指数。使用LAI-2000植物冠层分析仪计算叶面积指数（LAI）。

营养评估

所有列出的16个基因型都经过了一套六种营养性状的全面评估，包括本研究中蔬菜型（R₆）和籽粒型（R₈）特征。蔬菜型种子在完全发育的青荚期收集，而籽粒型种子在作物收获后获得。收集的种子首先风干24小时，然后转移到保持在70°C的烘箱中两天，或直到完全干燥。干燥后，两个阶段的种子都用研钵和杵精细研磨。从每个样品中称取0.5克粉末材料放入标记的锥形瓶中。向这些烧瓶中加入10-12毫升双酸混合物（由硝酸和高氯酸按4:1比例混合制备）。消化过程在150°C–200°C的热板上进行，直到溶液变清，然后让烧瓶冷却。将消化后的样品通过Whatman No. 42滤纸过滤到50毫升容量瓶中，并使用双蒸水将最终体积调整至50毫升。

使用原子吸收分光光度计（AAS）定量青荚期和籽粒期的铁、锌和锰浓度。仪器读数用稀释因子调整，表示为每100克种子中营养素的毫克数（毫克/100克）。钙的测定单独通过EDTA滴定法进行，使用氢氧化钠缓冲液和Calcon作为指示剂。淀粉含量使用蒽酮试剂根据Sengar描述的方法测定。此外，使用Folin–Lowry法测定蛋白质含量，如Sengar所述。

基因组DNA提取

通过分别收集每个木豆基因型的嫩叶样品开始分子变异性评估，并使用Saghai-Maroof等人推荐的CTAB方法进行DNA提取。提取的DNA经过纯化以去除污染物，如RNA、蛋白质和多糖。通过在含有0.5毫克/毫升溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上使用水平凝胶电泳运行来确认其纯度。

SCoT-PCR分析

使用15个起始密码子靶向（SCoT）引物序列进行PCR分析，以分析木豆基因型之间的多样性。最终体积为20.0微升的反应混合物包含1.0微升样品DNA、2微升引物、0.5微升dNTPs、2.5微升氯化镁、0.3微升Taq DNA聚合酶、2.0微升10× PCR缓冲液和11.7微升无菌双蒸水。使用的SCoT引物列表详见表1。扩增的PCR产物在1.4%琼脂糖凝胶上分离，并在溴化乙锭染色后可视化。检查凝胶图像，并由两名独立研究人员手动将条带记录为存在（1）或缺失（0）。模糊或模糊的条带重新扩增以确认，如果未解决则排除。

基于扩增DNA片段相对于其分子量的迁移距离确定条带的同源性，使用1 kb DNA Ladder作为参考标准。

统计分析

农艺性状

对收集的数据进行统计分析，以计算基因型（GCV）和表型变异系数（PCV）、遗传力以及使用OriginPro 2024和MS-Office excel 2010软件的遗传进展。GCV、PCV、遗传力（h2）和遗传进展的方差分量基于双向方差分析计算，其中基因型是固定效应，区组是随机效应以考虑实验设计。使用OriginPro的内置诊断工具通过残差分析检查正态性和方差同质性的假设。此外，使用软件GRAPES ver. 1.0.0按照Al-Jibouri等人描述的方法计算皮尔逊相关系数及相应的p值。热图和基因型聚类在RStudio中使用函数scale()、dist()、hclust()和dendrogram包创建。由于性状以不同单位测量，数据通过计算z分数进行标准化，每个值通过减去变量均值并除以其标准差使用scale()函数进行转换。在此标准化之后，使用适当的R包生成层次聚类和树状图，以基于标准化性状可视化基因型之间的关系。

营养分析

借助Minitab 19使用Welch检验生成箱线图，并使用OriginPro 2024软件生成树状图以可视化变异性。使用R-studio借助ggplot2、dplyr、tidyr和ggrepel包进行双向方差分析与Bonferroni事后检验，以分析基因型和发育阶段对营养性状的互作效应。热图和树状图中的聚类使用欧几里得距离和UPGMA（未加权配对算术平均法）聚类进行，在OriginPro中实现。进行1000次重复的Bootstrap分析以评估聚类可靠性。

分子分析

使用公式：多态性% =（多态性扩增片段数/总扩增片段数）× 100计算获得扩增产物的多态性百分比。根据Botstein等人（1980）计算多态性信息含量（PIC）和等位基因频率来评估标记信息量。在OriginPro 2024中使用欧几里得距离和UPGMA（未加权配对算术平均法）对二元矩阵进行聚类分析，并进行Bootstrap分析（1000次重复）以评估聚类稳定性。

结果

对16个木豆基因型的方差分析（ANOVA）显示，所有农艺性状均存在极显著差异（p < 0.01），表明存在显著的遗传变异性（表2）。50%开花、一级分枝数、叶绿素含量指数（R₆和R₈）、叶面积（R₆和R₈）、株高、首次采收天数、荚长、每荚种子数、100鲜种子重、100鲜荚重、荚宽和单株青荚产量等性状表现出显著变异。在评估的木豆基因型中，与标准对照GT-100和PKV-TARA相比，几个品种表现出优异的农艺性状（表S2）。例如，BDN-716和SKN-0632显示出 notably higher 株高（162.3–208.1厘米）和 grain pod yield（分别为371.4克和113.2克），优于对照（115.8–173.2厘米株高，200.5–189.5克青荚产量）。AKTM-11-10和AKTM-11-11表现出增强的一级分枝。此外，BDN-2004-2被鉴定为具有最高的每荚种子数、鲜荚重、荚长、100鲜种子重和荚宽，明显高于对照。然而，BDN-716被鉴定为具有最高的单株青荚产量。这些性状的高遗传变异表明存在多样化的遗传资源，可用于育种计划以提高产量潜力。

表3展示了遗传参数的估计。100鲜荚重（99%）、R₈期叶面积（95%）、株高（88%）和荚长（84%）等性状的广义遗传力（h2bs）值较高，表明存在强烈的遗传控制。单株青荚产量的GCV和PCV较高，分别为30.11%和42.16%，表明具有很高的选择和改良潜力。单株青荚产量的基因型方差为3774.53，其基因型变异系数最高（30.11%），其次是R₆期叶面积（29.69%）和100鲜荚重（24.85%）。最低的基因型变异系数在R₈期叶绿素含量指数（3.15%）中观察到。

除了R₆期叶绿素含量指数、R₈期叶绿素含量指数和一级分枝数外，所有产量构成性状的基因型方差幅度均高于环境方差。然而，这三个性状的遗传力相对较低（分别为30%、44%和40%），遗传进展非常低，表明这些性状主要受环境因素控制，并且遗传力不高。

叶绿素含量和叶面积动态

叶绿素含量在R₆和R₈期之间变化，平均值分别为53.68和49.97（表3）。同样，R₆期的叶面积（42.38平方厘米）低于R₈期（60.70平方厘米），表明随着生长叶片扩张增加。热图（图2）直观地表示了16个木豆基因型在农艺和营养性状上的变异。这张热图伴随着层次树状图，显示了多个木豆基因型各种农艺和营养性状的z分数标准化值，提供了性状与基因型互作的全面视图。树状图便于同时对基因型（行）和性状（列）进行聚类，从而识别具有相似性状模式的基因组和在整个评估种质中具有一致反应的性状簇。颜色梯度代表标准化性状值，色调从蓝色（低于平均值）到白色（平均值）再到红色（高于平均值），允许快速评估每个基因型的相对性状表现。这种双聚类方法有效地将BDN-716和BDN-2004-2识别为有前景的基因型。

产量相关性状的相关性分析

相关系数（图3）是在R₆和R₈期合并数据上计算的，以捕捉整体性状关系。皮尔逊相关分析揭示了蔬菜型木豆各种农艺性状之间的显著关联。单株青荚产量（GPY）与R₆期叶绿素含量（R6CC）之间观察到强正相关（r = 0.69），表明荚发育期间较高的叶绿素含量增强了产量潜力。GPY还与荚宽（PW）（r = 0.62）、100鲜种子重（FSI）（r = 0.82）和100鲜荚重（PSI）（r = 0.87）表现出显著正相关，表明荚相关性状 substantially influence yield。50%开花天数（50%F）与株高（PH）负相关（r = -0.56），意味着早花基因型往往较矮。此外，50%F与首次采收天数（DFH）显示出显著正相关（r = 0.57），表明延迟开花导致成熟期延长。

荚和种子相关性状

荚宽（PW）和荚长（PL）之间注意到高度显著的正相关（r = 0.47），突出了它们对荚发育的贡献。类似地，100干种子重（DSI）与100鲜种子重（FSI）强相关（r = 0.85），强化了鲜种子重作为干种子积累预测指标的可靠性。每荚种子数（NS/P）也与FSI正相关（r = 0.54*）。

不同生长阶段木豆的营养成分

对16个木豆基因型和六个营养性状在两个不同阶段R₆和R₈的双向方差分析（ANOVA）表明，所有测试性状在基因型和阶段的主效应以及基因型与阶段的互作效应上均显示极显著，表明基因型和发育阶段在生化参数上存在显著分化（表4）。Bonferroni事后检验确定了在每个阶段内和每个性状上哪些基因型均值存在显著差异。

蛋白质和碳水化合物

在R₆和R₈阶段，多个基因型组存在显著差异；均值分离证实基因型选择强烈影响每个发育阶段的生化谱。蛋白质水平在成熟期显著增加（图4；补充表3），与其他豆类的发现一致。碳水化合物含量也在成熟期显著增加（图4），AKTM-1644显示最高水平，AMAR最低。

钙

阶段效应非常明显，所有基因型在R₈期的钙水平均显著高于R₆期（图4）；基因型排名在阶段之间发生变化，反映了互作效应。最高钙含量在BDN-2004-2的成熟种子中观察到，而最低在AMAR的青种子中发现。

锌、铁、锰

这些微量营养素也显示出强烈的显著基因型差异（Bonferroni调整后），性状受发育阶段修改；分组在R₆和R₈之间 substantially shifted。有趣的是，当我们使用所有三种营养素的阶段特异性均值数据进行单因素方差分析与Welch检验时，阶段之间的差异不显著（图4；补充图1）。Bonferroni事后检验的显著结果反映了更精细尺度的变异，这是对聚合均值的单因素检验无法检测到的。

互作图清楚地描述了木豆基因型营养浓度从青荚期（R₆）到成熟种子期（R₈）的转变（图5）。对于钙和碳水化合物，几乎所有基因型在成熟过程中都显示出稳定且 uniform 的增加，表明这些营养素在发育种子中显著积累。特别是钙水平，在每个基因型的R₈期 consistently rise，证明了成熟的普遍效应和基因型之间的细微差异。

铁和锌的模式更加多样化。一些基因型在成熟种子期保留或增加其含量，而其他基因型显示下降。例如，锌在R6期在AKTM-11-10等基因型中较高，但在BDN-2004-2和BDN-716的R₈期更稳定或增加，揭示了锌的变化 strongly depend on genotype and developmental timing。

锰也表现出显著的基因型特异性反应。大多数基因型保持稳定或显示从R₆到R₈适度增加，但AKTM-11-12和AKTM-11-11等基因型脱颖而出，在R₈期水平高得多。这突出了基因型之间营养储存和移动的多样性。

蛋白质显示相似趋势，某些基因型随着种子成熟 sharp increase，如AKTM-11-10和AKTM-11-11，而其他基因型保持更恒定。这些差异强调了基因型和阶段在决定营养组成中的作用。

还生成了一个圆形树状图（图6），基于其营养谱将16个基因型分为三个簇。簇I包含两个基因型（AKTM-11-06和AKTM-11-10），簇II有十个基因型（包括两个对照品种），簇III包含四个基因型。大多数研究材料在营养含量上优于对照品种。圆形树状图不仅对16个木豆基因型进行了分类，而且基于它们在R₆和R₈期营养谱的相似性揭示了 clear groupings。同一簇内的基因型，如BDN-2004-2、BAHAR和BDN-716，在关键营养素（包括钙、铁、锌、锰、蛋白质和碳水化合物）上表现出密切相关的水平，如它们在图中相似颜色带所示。这表明这些基因型在发育阶段具有 comparable nutritional compositions。类似地，包含AKTM-11-06、AKTM-11-10和AKTM-11-07的簇反映了类似的营养模式，表明这些品种在营养上相似。总的来说，聚类提供了关于哪些基因型具有匹配营养含量的宝贵见解，从而促进育种计划中营养改良的 targeted selection。

分子分析

使用15个SCoT标记的基因型评估鉴定了16个木豆基因型之间的多态性。在引物中，八个显示扩增，六个显示100%多态性（图7），证实了它们用于遗传研究的有效性。使用SCoT-2、SCoT-15、SCoT-11和SCoT-12的扩增谱显示了基因型之间的 clear polymorphisms，突出了它们在遗传指纹识别和标记辅助选择（MAS）中的效用。多态性信息含量（PIC）值范围在0.4145和0.8397之间，如表5所示。较高的PIC值反映了基因型之间更高水平的多态性，允许更准确地估计遗传距离。在引物中，SCoT-13表现出最高的PIC值0.844，其次是SCoT-19（0.8397）和SCoT-18（0.8102）。PIC值的广泛范围表明它们用于评估遗传多样性的效用。类似范围由Zavinon等人在木豆中使用SSR标记的研究中报道。使用Jaccard相似系数和UPGMA树状图（图8）的遗传多样性分析揭示了基因型之间的显著变异，相似系数范围从0.45到0.91。确定了两个主要簇，AKTM-11-06和AKTM-11-07表现出最高相似性（0.91），而BDN-716和ICPL-151最低（0.45）。

讨论

木豆基因型的农艺评估揭示了品种之间的显著变异性，与标准对照GT-100和PKV-TARA相比，几个品种表现出优异的性状。这种变异性是旨在提高产量和适应性的育种计划的重要资源，与先前强调木豆种质内广泛遗传多样性的报告一致。BDN-716、BDN-2004-2和SKN-0632等基因型的优异株高、荚产量和种子特征证明了这些品系对提高生产力和农民偏好的潜力。这与选择具有更高生物量和产量相关性状的基因型用于多种目的（包括食物和饲料）的公认重要性一致。此外，一级分枝数和荚长等形态性状的基因型差异强调了 targeted breeding 以优化具有农艺重要性的特定性状的范围。

研究结果表明，表现出高遗传力和高遗传进展的性状，如单株青荚产量、100鲜荚重、株高和R₈期叶面积，可以有效地用于育种计划中的选择。100鲜荚重观察到高遗传力伴随高遗传进展，表明该性状主要受遗传控制，可用于后续育种努力中的选择。结果与Mahiboobsa等人、Oyiga和Uguru、Rao和Rao、Vange和Moses的发现一致，他们也报告了木豆产量相关性状的高遗传力。另一方面，荚宽、每荚种子数和一级分枝数等性状表现出低遗传进展，表明这些性状更多地受非加性基因作用影响。因此，杂种优势育种可能是改良这些性状的更合适策略。这些发现与Johnson等人一致，他们强调了遗传力估计 coupled with genetic advance 在育种计划中有效选择的重要性。

相对较低的环境影响对大多数性状的遗传控制支持了通过选择可以实现改良的观点。然而，R₆和R₈期叶绿素含量指数以及一级分枝数等性状显示低遗传力和遗传进展，可能不适合直接选择。因此，育种努力应 focus on traits with higher heritability and genetic advance 以提高木豆的整体生产力。这些发现与Akilan等人、Linge等人、Patel和Patel、Saxena等人的工作一致，他们也在木豆中观察到类似的遗传力模式。

叶绿素含量在两个阶段之间变化，平均值分别为53.68和49.97（表3）。同样，R₆期的叶面积（42.38平方厘米）低于R₈期（60.70平方厘米），表明随着生长叶片扩张增加。热图（图2）直观地表示了16个木豆基因型在农艺和营养性状上的变异，基于相似性聚类基因型并突出性状表达的差异。

关键农艺性状之间观察到的显著相关性表明它们在育种计划中 indirect selection 的潜力。GPY与荚相关性状之间的强关联强调了荚大小和种子重在提高产量中的重要性。木豆和相关豆类中报告了类似趋势。早花和株高之间的负相关与其他豆类的发现一致，其中较矮的植株由于快速营养生长往往成熟较早。

基因型、阶段及其互作对所有性状的同时显著性证明了所研究材料性状遗传和发育调控的复杂性。基因型是所有性状的高度显著变异来源，表明测试品系之间生化谱存在 robust genetic diversity。这证明了进一步的分子表征和 targeted breeding 的合理性。发育阶段（R₆ vs. R₈） consistently produced pronounced changes，特别是对于钙和碳水化合物，揭示了重要的生理转变。所有性状的显著基因型与阶段互作强调了基因型排名不是阶段独立的；育种决策或基因型选择必须 tailored to specific developmental windows。

成熟期钙和碳水化合物含量的显著增加支持了先前表明随着种子成熟营养分配转移的报告。这些发现与Saxena, Vijaya Kumar, 等人关于碳水化合物的结果一致，但与钙的结果矛盾。籽粒期观察到的较高锰浓度与Susmitha等人的发现一致，他们报告成熟种子中锰水平增加，可能反映了成熟过程中营养素在种子发育和代谢过程中的作用。相反，蔬菜期铁和锌含量升高与Saxena等人的观察相符，表明青荚 possess enhanced levels of these micronutrients。这些差异突出了在评估木豆品种对人类消费的营养价值和旨在提高微量营养素含量的育种计划时考虑生长阶段的重要性。成熟期观察到的蛋白质增加与其他豆类的研究一致，突出了成熟木豆种子的 enhanced nutritional value。基于营养含量的基因型遗传聚类表明存在 distinct genetic variation，可用于生物强化计划。鉴定出在营养含量上优于对照品种的基因型为未来旨在改善木豆膳食质量的育种努力提供了有前景的材料。结果还提供了证据，即品质性状的改良应考虑基因型和阶段，因为一个阶段的优异表现并不总是 extrapolate to later developmental windows。

分子分析 confirmed the genetic diversity within the studied genotypes。用SCoT标记观察到的高多态性验证了它们在木豆遗传研究中的有效性。PIC值的广泛范围证明了这些标记在评估遗传多样性方面的有效性。在先前使用SSR标记对木豆的研究中观察到了类似的PIC值范围。遗传相似性的变异表明，远缘基因型之间的杂交可以是一种可行的策略，以 broaden the genetic base and incorporate novel traits，如耐旱性和抗病性。该研究强调了基于标记的遗传多样性评估对增强木豆育种计划的效用。

结论

本研究强调了木豆基因型之间的显著遗传变异性，对产量改良和营养增强具有 promising implications。BDN-716在所有研究的基因型中给出了最高的