刺激触发型从头设计蛋白质生物材料的可控构建与应用研究

《Cell Biomaterials》：Stimuli-triggered formation of de novo-designed protein biomaterials

本刊推荐：为解决天然蛋白质材料功能单一、可控性差的问题，研究人员开展基于从头设计蛋白质的刺激响应型生物材料研究。通过将FKBP/FRB二聚化系统与多价自组装蛋白核心融合，实现了雷帕霉素触发的水凝胶和生物分子凝聚体可控形成。该材料体系具有可调节的粘弹性（0-1 kPa）和动态形成特性，为组织工程和细胞内相分离研究提供了新型工具平台。

　　

在生物材料研究领域，蛋白质基水凝胶因其优异的生物相容性和仿生特性备受关注。然而，传统蛋白质材料大多依赖天然存在的结构模块（如弹性蛋白样多肽、卷曲螺旋等），其功能可调性和响应特性受到极大限制。更为重要的是，现有材料体系往往缺乏精确的时空控制能力，难以模拟生物体内动态复杂的形成过程。这一局限性严重制约了蛋白质材料在组织工程、药物递送和细胞行为调控等领域的应用潜力。

与此同时，生物分子凝聚体（biomolecular condensates）作为细胞内无膜细胞器的新兴研究热点，其异常调控与神经退行性疾病、癌症等多种病理过程密切相关。虽然天然凝聚体系统为生物学研究提供了重要模型，但缺乏标准化、可调控的合成体系使得机制研究面临挑战。如何构建具有可控物性参数的人工凝聚体，成为当前合成生物学和生物材料领域的核心难题。

针对上述挑战，Nicole E. Gregorio等研究者在《Cell Biomaterials》发表了创新性研究成果。他们巧妙结合从头蛋白质设计（de novo design）与化学诱导二聚化技术，开发了一套新型刺激响应型蛋白质材料平台。该平台的核心设计理念是通过计算设计的多价自组装蛋白质作为结构骨架，与雷帕霉素（rapamycin）诱导的FKBP/FRB蛋白质对进行融合，实现了从分子到宏观材料的多层级可控组装。

研究团队采用RFdiffusion等先进计算工具设计了系列具有特定对称性（二聚体、三聚体、四聚体、六聚体和十二聚体）的蛋白质寡聚体核心结构。通过基因工程方法，将FRB结构域与二聚体核心融合，FKBP结构域与多价寡聚体核心融合，构建了完整的材料组建库。当加入小分子诱导剂雷帕霉素时，FKBP/FRB特异性结合触发多价蛋白质网络的形成，最终实现从溶液到凝胶态的可控转变。

关键技术方法包括：1）基于RFdiffusion和ProteinMPNN的从头蛋白质设计流程；2）负染色电子显微镜（nsEM）验证寡聚体组装形态；3）流变学表征材料粘弹性性能；4）荧光恢复后漂白（FRAP）技术分析凝聚体动力学特性；5）细胞内核转染与荧光成像验证细胞内凝聚体形成。

研究结果系统揭示了材料体系的多维度调控特性：

材料价态调控宏观性能

通过改变多价蛋白质核心的组装价态（从三聚体到十二聚体），研究人员成功实现了材料刚度的精确调控。流变学测试表明，存储模量（G'）随价态增加而提升，在六聚体达到平台期（约1 kPa）。频率扫描实验进一步显示，所有材料均表现出典型的物理交联网络特征，其粘弹转变频率随价态增加而降低。这一发现为软组织工程材料的力学性能匹配提供了重要设计依据。

小分子浓度精细调节材料特性

研究团队创新性地利用雷帕霉素浓度作为调控参数，实现了材料交联密度的动态调节。当雷帕霉素与FKBP/FRB的摩尔比为0.75:1时，材料仍保持良好稳定性（14天降解率约20%），而0.5:1比例则导致明显缺陷网络形成。这种"剂量依赖性"调控策略为药物控释等需要精确控制降解速率的应用场景提供了新思路。

多尺度相行为调控

在低浓度条件下，该蛋白质系统展现出丰富的相分离行为。相图分析表明，高价态组装体（六聚体、十二聚体）在较低分子拥挤条件下即可形成凝聚体，而低价态体系需要更高浓度的聚乙二醇（PEG）诱导。形态学观察发现，三聚体形成典型的液滴状结构，而高价态体系则呈现不规则聚集形态，暗示了材料内部物理状态的差异。

FRAP动力学分析揭示了意想不到的现象：所有价态的凝聚体在2分钟内仅显示不足15%的荧光恢复，表明其内部动力学过程极为缓慢。这一结果与基于非共价作用的物理交联网络预期不符，研究人员推测可能与FKBP/FRB/雷帕霉素复合物极高的结合亲和力（解离常数K_d ≈ 12 nM）有关。长时间追踪实验证实，凝聚体融合和重排确实发生在小时级时间尺度上。

时空可控的凝聚体形成

通过实时成像技术，研究团队成功捕捉到雷帕霉素触发凝聚体形成的动态过程。在HEK293T细胞模型中，诱导表达EGFP标记二聚体和mCherry标记六聚体的细胞在加入雷帕霉素后出现明显的荧光共定位 puncta，证明了该平台在活细胞内实现可控凝聚体形成的能力。这一突破为研究细胞内相分离的生物学功能提供了可编程工具。

讨论部分深入分析了该研究的多重创新价值。首先，该工作首次将从头蛋白质设计策略与刺激响应材料构建相结合，突破了传统蛋白质材料的局限性。模块化设计理念允许通过替换不同的二聚化系统（如光控SpyLigation）实现多种刺激响应模式，极大拓展了材料的功能多样性。

其次，研究揭示了微观凝聚体与宏观水凝胶之间既关联又差异的物理特性。虽然雷帕霉素浓度在宏观尺度显著影响材料刚度，但在微观凝聚体尺度却未观察到明显的物性变化。这种尺度效应提示我们在设计跨尺度生物材料时需要特别关注分子机制与宏观表现之间的复杂关系。

在应用前景方面，该技术平台为生物医学研究提供了多重可能性：可注射水凝胶可用于细胞封装和组织工程；时空可控的凝聚体系统为研究相分离在疾病中的作用机制提供了标准化模型；而完全基因编码的特性则确保了良好的生物相容性和细胞内应用潜力。

需要特别指出的是，雷帕霉素作为mTOR通路抑制剂，其生物学效应可能干扰细胞正常功能。研究人员建议可考虑植物来源的二聚化系统（如Pyl/ABl、GID1/GAI）或设计全新的化学诱导二聚体以提高生物正交性。

这项研究标志着蛋白质材料设计范式的重大转变——从依赖天然模块到完全可编程的人工设计。随着计算蛋白质设计技术的不断发展，特别是扩散模型等人工智能方法的成熟，我们有望实现更加复杂和功能化的生物材料设计。这种"由下而上"的合成生物学策略不仅扩展了生物材料工具箱，更为我们理解生命系统中的自组装原理提供了独特视角。

未来研究方向包括开发具有更快速动力学特性的交联系统、探索材料形成过程中的细胞响应机制、以及将该平台应用于特定疾病模型的研究。随着这些挑战的逐步攻克，从头设计的刺激响应蛋白质材料有望在再生医学、药物递送和合成生物学等领域发挥重要作用，最终实现"设计-构建-应用"的完整技术闭环。