三重周期极小曲面仿生梯度微孔支架通过调控巨噬细胞极化增强骨整合

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Biomimetic Gradient Microporous Scaffold with a Triply Periodic Minimal Surface Enhances Osseointegration by Modulating Macrophage Polarization

本研究针对骨植入材料引发的免疫炎症反应影响骨整合效果的问题，开展了基于三重周期极小曲面（TPMS）结构的仿生梯度微孔钛合金支架研究。通过选择性激光熔化技术制备了孔径650-350 μm的梯度支架，发现其弹性模量与骨组织匹配良好，并能有效促进巨噬细胞向M2表型极化，增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。动物实验证实该支架可减轻局部炎症反应并促进新骨形成，为兼具免疫调节和骨整合功能的骨修复材料设计提供了新思路。

　　

在骨科临床实践中，严重骨缺损的修复一直是重大挑战。虽然自体骨移植是金标准，但来源有限且会造成二次损伤；而异体骨移植则存在免疫排斥风险。近年来，骨组织工程支架为这一难题带来了新希望，其中钛合金因其优良的生物相容性和机械强度成为理想选择。然而，传统植入物与宿主骨组织的弹性模量不匹配会导致"应力遮挡"效应，引起周围骨吸收；更关键的是，植入材料会触发免疫炎症反应，若巨噬细胞持续处于促炎的M1表型，将导致慢性炎症和植入失败。因此，如何设计既能匹配骨骼力学性能、又能调控免疫微环境的新型支架，成为骨再生领域的研究热点。

天然骨骼本身具有从皮质骨到松质骨的梯度孔隙结构，这种结构巧妙地将外层的力学强度与内层的营养传输功能结合在一起。受此启发，研究人员开始探索仿生梯度多孔结构。在众多结构设计中，三重周期极小曲面（TPMS）因其高比表面积、优良的渗透性和可调参数设计而备受关注。其中，P型（Primitive）TPMS结构在力学性能和成骨活性方面表现尤为突出。但是，TPMS结构如何影响免疫微环境，特别是梯度TPMS结构是否具有免疫调节功能，尚不清楚。

在这项发表于《BIOMATERIALS RESEARCH》的研究中，研究人员通过选择性激光熔化（SLM）技术制备了基于TPMS-P结构的仿生梯度微孔钛合金支架（孔径650-350 μm），并以实体支架（0 μm）和均质微孔支架（500 μm）作为对照，系统评估了这些支架在骨整合和免疫调节方面的双重作用。

研究采用的主要技术方法包括：通过选择性激光熔化技术制备三种不同类型的钛合金支架；利用扫描电子显微镜和微计算机断层扫描进行结构表征；通过体外细胞实验评估支架对骨髓间充质干细胞（BMSCs）和巨噬细胞行为的影响；建立大鼠皮下植入模型和兔股骨缺损模型进行体内验证。

设计、制备和表征Ti6Al4V支架

研究人员成功制备了梯度微孔、均质微孔和实体三种钛合金支架。结构表征显示，均质微孔支架的孔径为500±8 μm，孔隙率为56.96%±0.3%；梯度微孔支架的最大孔径为650±12 μm，最小孔径为350±6 μm，孔隙率为58.10%±0.4%。力学测试表明，两种微孔支架的弹性模量（均质：17.34±1.29 GPa，梯度：16.05±1.05 GPa）均与天然骨骼（3-30 GPa）相匹配，有效降低了应力遮挡风险。此外，梯度微孔支架表现出最佳的亲水性，有利于细胞粘附和营养交换。

生物相容性评价

体外实验证实所有支架均具有良好的生物相容性。活死染色和CCK-8检测显示，梯度微孔支架上的BMSCs增殖活性最强。细胞骨架染色进一步表明，梯度微孔支架上的细胞具有更伸展的肌动蛋白丝和更密集的细胞间网络，提示其更利于细胞粘附和扩展。

BMSCs在支架上的成骨分化

成骨分化评估显示，梯度微孔支架在促进碱性磷酸酶（ALP）活性、矿化结节形成以及成骨相关基因（BMP-2、RUNX2、COL-1、OCN）表达方面均优于其他两组。特别是在成骨诱导14天后，梯度微孔支架组的ALP活性和ARS染色强度均显著高于对照组，表明其具有更强的成骨诱导能力。

支架对巨噬细胞生物相容性和极化的影响

巨噬细胞实验表明，所有支架均支持细胞增殖。然而，梯度微孔支架能够显著促进巨噬细胞向抗炎的M2表型极化，表现为Arg-1和IL-10表达上调，同时TNF-α和iNOS等M1标志物表达下降。酶联免疫吸附试验（ELISA）结果与实时定量PCR（RT-qPCR）数据一致，证实梯度微孔支架具有最佳的免疫调节性能。

巨噬细胞条件培养基诱导BMSCs的成骨分化

为了验证巨噬细胞极化对成骨分化的影响，研究人员将BMSCs培养在巨噬细胞条件培养基中。结果显示，来自梯度微孔支架组的条件培养基最能促进BMSCs的成骨分化，表现为ALP活性增强、矿化结节增多以及成骨基因表达上调，表明M2型巨噬细胞分泌的因子确实有利于骨形成。

大鼠皮下植入模型中巨噬细胞极化评估

体内实验进一步证实了体外发现。皮下植入14天后，免疫荧光染色显示梯度微孔支架周围组织中有更多的CD206阳性（M2型）巨噬细胞和较少的CCR7阳性（M1型）巨噬细胞，表明该支架在体内也能有效诱导抗炎微环境。

X射线成像和微CT分析

兔股骨缺损模型显示，植入8周后，梯度微孔支架组的新骨形成量（BV/TV）、骨表面积（BS/TV）和小梁厚度（Tb.Th）均显著高于其他两组。微CT三维重建清晰显示，梯度微孔支架内部有更多的新骨长入。

组织切片分析

组织学染色结果与影像学发现一致。梯度微孔支架组不仅在外表面有新骨形成，在支架内部也观察到深度的骨长入，表明其具有最佳的骨整合效果。相比之下，实体支架组的新骨仅局限于支架表面。

体内支架周围巨噬细胞极化和骨再生

免疫组织化学染色显示，梯度微孔支架周围的骨组织中BMP-2和RUNX2等成骨标志物表达最高，同时Arg-1（M2标志）表达较强而CCR7（M1标志）表达较弱，进一步证实了免疫调节与成骨活性之间的正相关关系。

综合讨论表明，TPMS-P基仿生梯度微孔支架通过多种机制协同促进骨整合。在结构上，梯度孔径设计既提供了细胞粘附所需的较小孔隙（350 μm），又保留了营养传输和血管长入所需的较大孔隙（650 μm）。TPMS结构的连续曲面为细胞提供了多样的拓扑学 cues，有利于细胞伸展和分化。在免疫调节方面，支架的特定孔径和曲面特征可能通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控巨噬细胞极化，同时通过FAK/AKT/YAP通路影响细胞力学转导，最终创造有利于骨再生的免疫微环境。

该研究的创新之处在于首次系统阐明了TPMS-P基梯度微孔结构通过免疫调节促进骨整合的双重功能，为设计"智能"骨修复材料提供了新思路。未来研究可进一步优化梯度参数，探索更广泛的孔径组合，并延长观察时间以评估长期效果。此外，采用可降解材料如羟基磷灰石或聚己内酯进行类似研究，将有助于更精确地评估支架内部的生物学过程。

总之，这项研究不仅证实了仿生梯度微孔支架在骨再生中的优势，更重要的是揭示了其免疫调节功能，为开发兼具力学适配性和生物活性的新一代骨植入物奠定了理论基础，具有重要的临床转化价值。