AdaptUC：基于生物质前体合成调控的微生物非适应性碳源进化驱动策略

《Research》：Exploring Biomass Precursor Synthesis as a Determinant in Microbial Adaptation to Unadapted Carbon Sources with AdaptUC

本研究针对工业微生物难以利用甲醇、甲酸盐和木糖等可再生底物的瓶颈问题，开发了计算框架AdaptUC。该框架通过基因组尺度代谢模型预测基因敲除策略，构建适应性实验室进化（ALE）的起始菌株，量化非适应性碳源与生长的耦合程度。研究表明，生物质前体依赖非适应性碳源合成的比例决定了进化驱动力（SADF）和底物最低需求（UC/Co）。案例验证显示，AdaptUC能识别优于文献报道的工程策略，为可再生能源的生物制造提供新工具。

　　

随着全球对可持续生物制造需求的日益增长，利用可再生能源替代传统粮食基底的碳源已成为合成生物学的重要方向。甲醇、甲酸盐和木糖等来源于非粮生物质或工业废弃物的化合物，展现出巨大的工业应用潜力。然而，许多工业微生物菌株缺乏天然代谢这些“非适应性碳源”的能力，即便引入异源代谢途径，仍常因代谢不平衡、酶动力学不佳或调控障碍等问题无法有效生长。

为解决这一挑战，适应性实验室进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）成为一种关键手段，通过逐步驯化使微生物适应非天然底物。但如何设计起始菌株，以最大化进化驱动力并降低底物需求，仍是代谢工程领域的难点。传统计算工具如OptKnock、OptForce等多聚焦于产物合成耦合，缺乏针对碳源同化驱动的专门优化方法，且受限于组合爆炸问题难以在全基因组尺度模型中实现高效搜索。

本研究团队开发了名为AdaptUC的计算框架，其核心创新在于将生物质前体合成对非适应性碳源的依赖比例，作为进化驱动力和底物需求的关键决定因子。AdaptUC包含两种双层次混合整数线性规划（MILP）算法——AdaptUC-A与AdaptUC-B，分别针对“共底物利用”和“单一底物利用”两种进化目标。通过在三重内层问题中约束菌株在不同底物条件下的生长反应，AdaptUC能够在包含数千个反应的全基因组代谢模型中，精准预测使菌株生长与非适应性碳源摄取耦合的基因敲除靶点。

为验证方法的有效性，研究团队以大肠杆菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为模式生物，聚焦甲醇利用场景。在引入异源甲醇同化途径（包括甲醇脱氢酶、3-己酮糖-6-磷酸合酶和6-磷酸-3-己酮糖异构酶）后，利用AdaptUC预测基因敲除策略，并采用两个定量指标进行评估：非适应性碳源与共底物的最小摄取比（UC/Co），以及底物同化驱动力（Substrate Assimilation Driving Force, SADF），后者定义为生长速率增益与底物摄取增量之比，反映进化压力强度。

关键技术方法

本研究主要依托基因组尺度代谢模型（iML1515 for E. coli, iCW773 for C. glutamicum），通过双层次MILP算法（AdaptUC-A/AdaptUC-B）求解基因敲除组合，满足三重生长耦合约束。算法利用Karush-Kuhn-Tucker条件将双层次问题转化为单层次MILP，结合整数切割策略枚举多解。通量平衡分析（Flux Balance Analysis, FBA）用于模拟代谢表型，关键参数通过强对偶性约束线性化。

设计原理与算法验证

AdaptUC通过三个内层问题分别模拟菌株在非适应性底物单独存在、共底物单独存在以及两者共存时的生长表现，外层约束确保敲除后菌株满足预设生长耦合目标。例如，AdaptUC-A要求菌株在非适应性碳源单独存在时生长下降超过90%，而AdaptUC-B则要求其仍能保持50%以上的生长能力。研究成功预测了5个已实验验证的甲基营养大肠杆菌策略，包括通过阻断核酮糖-5-磷酸异构酶（rpi）等关键节点，迫使共底物碳流经RuMP循环与甲醛结合。

代谢工程策略设计与文献对比

在大肠杆菌中，AdaptUC识别出具有更高SADF和更低UC/Co的新策略。例如，以葡萄糖酸为共底物，敲除fba（果糖二磷酸醛缩酶）、rpe（核酮糖-5-磷酸差向异构酶）和f6pa（果糖-6-磷酸醛缩酶）的组合，SADF达24.9 gDW/mmol，UC/Co仅为0.001，显著优于已报道策略。在谷氨酸棒杆菌中，简单改变共底物（如琥珀酸、乙酸）即可将SADF提升5.2倍，UC/Co降低91%，凸显代谢网络结构的物种特异性差异。

生长耦合程度决定进化效能

研究进一步揭示，非适应性碳源与生物质合成的耦合程度是决定SADF和UC/Co的关键。根据依赖比例，策略可分为最小耦合（仅少数前体依赖）、中间耦合和完全耦合。最小耦合策略因仅需合成少量必需生物质组分（如细胞壁前体KDO₂-lipid IV_A和胞壁酰单元），允许共底物承担大部分碳流，从而在低甲醇需求下产生高进化驱动力。相反，完全耦合策略（如木糖共底物下敲除rpi）要求所有生物质合成均需甲醇参与，导致UC/Co升高而SADF降低。

AdaptUC-A与AdaptUC-B的协同工作流

针对不同进化目标，研究提出整合AdaptUC-A和AdaptUC-B的实践路径。若直接设计单一底物生长策略（AdaptUC-B）失败，可先采用AdaptUC-A实现共底物依赖型生长，再通过适应性进化逐步削减共底物，最终通过关键基因回补（如重新引入rpe）过渡到单一底物利用。这种分段策略显著提高了驯化成功率。

结论与展望

AdaptUC通过量化生物质前体依赖比例，建立了非适应性碳源同化与进化驱动力的定量关联，为ALE起始菌株设计提供了新范式。该方法不仅成功复现了文献中的有效策略，还预测出具有更低底物需求和更强进化压力的新靶点，突破了传统代谢设计工具的产品导向局限。未来，结合自动化生物铸造厂和高通量学习框架，AdaptUC有望进一步整合热力学和酶约束模型，提升预测真实性，推动可再生能源在工业生物制造中的广泛应用。